1、前言GB/T 18932的本部分的附录A和附录B为资料性附录。本部分由中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局提出.本部分由中华全国供销合作总社归口。本部分起草单位g中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。GB/T 18932.20-2003 本部分主要起草人z庞国芳、刘永明、范春林、曹彦忠、张进杰、李学民、贾光群a本部分系首次发布的国家标准。1 范围蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法气相色i普质谱法GB/T 18932的本部分规定了蜂蜜中氯霉素残留量气相色谱质谱测定方法。本部分适用于蜂蜜中氯霉素残留量的测定。本部分的氯霉素方法检出限，0.10g/kg。2 规范性引用文件GB/T 18932.20-200
2、3 下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6379 测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性(GB/T6379-1986 ,neq ISO 5725 ,1 981) GB/T 6号82分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-1992, neq ISO 3696 ,1 987) 3 原理蜂蜜试样用水溶解后，用乙酸乙醋提取试
3、样中残留的氯霉素，提取液浓缩后再用水溶解，OasisHLB固相萃取柱净化，经硅烧化后用气相色谱一质谱仪测定，外标法定量。4 试剂和材料4.1 水，GB/T6682规定的一级水。4.2 甲醇2色谱纯。4.3 乙腊z色谱纯。4.4 乙酸乙酶g色谱纯。4.5 乙腊+水0+7)，量取20mL乙腊(4.3)与140mL水混合。4. 6 Oasis HLB固相萃取柱或相当者，60mg , 3 mL。使用前分别用3mL甲醇和5mL水预处理，保持柱体湿润。4.7 口比睫g色谱纯。4.8 六甲基二硅氮烧:色谱纯。4.9 三甲基氯硅炕2色谱纯。4.10 硅烧化试弗，将丸份口比睫(4.7)、三份六甲基二硅氮烧(4.
4、8)和一份三甲基氯硅;皖(4.9)混合。4.11 氯霉素标准物质z纯度注99%。4.12 氯霉素标准储备溶液，0.1mg/mL。准确称取适量的氯霉素标准物质(4.11)，用甲醇配成0.1 mg/mL的标准储备液。储备液贮存在4C冰箱中，可使用两个月。4.13 氯霉素基质标准工作溶液z选择不含氯霉素的蜂蜜样品五份，按本方法提取(7.l)和净化(7.2)后，制成蜂蜜空白样品提取液，用这五份提取液分别配成氯霉素浓度为O.4 ng/mL , 1. 0 ng/mL, 3.0 ng/mL, 10 ng/mL,20 ng/mL溶液，经硅烧化后配成标准工作溶液，在4C保存.可使用一周。GB/T 18932.2
5、0-2003 5 仪器5.1 气相色谱-质谱仪2配有化学源.5.2 分析天平:感量0.1mg和O.Olg各-台。5.3 自动浓缩仪或相当者。5.4 氮气吹干仪。5.5 振荡器。5.6 液体混匀器。5.7 固相萃取装置。5.8 贮液器:50mL。5.9 真空泵:真空度应达到80kPao 5.10 离心机。5.11 具塞试管:10mL。5.12 移液器:0.05mL , 10 mLo 5.13 离心管:50mL，具塞.6 试样的制备与保存6.1 试样的制备对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀.对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60(;的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温.分
6、出0.5kg作为试样，置于样品瓶中，密封，并做上标记。6.2 试持保存将试样于常温下保存.7 测定步骤7.1 提取称取5g试样，精确到0.01g.置于50mL具塞离心管中，加入5mL水，于液体混匀器上快速混合1 min，使试样完全溶解。加入15mL乙酸乙醋，在振荡器上振荡10min，在3000 r/min下离心10 min，吸取上层乙酸乙醋12mL转入自动浓缩仪的蒸发管中，用自动浓缩仪在55(;减压蒸干，加入5 mL水溶解残渣，待净化。7.2 净化将提取液(7.1)移人下接OasisHLB柱(4.6)的贮液器中，溶液以小于等于3mL/min的流速通过Oasis HLB固相萃取柱，待溶液完全流出
7、后，用2X5mL水洗蒸发管并过柱，然后再用5mL乙脯+水(4.5)洗柱，弃去全部淋出液。在65kPa的负压下，减压抽干10min，最后用5mL乙酸乙酣(4.4)洗脱，收集洗脱液于10mL具塞试管(5.11)中，于50(;水浴中用氮气吹干仪吹干，待硅炕化。7.3 硅镜化在上述10mL具塞试管中加入50L硅烧化试剂(4.10儿混合0.5min.l min，立即用正己烧定容至1mL，待测定，7.4 测定7.4.1 气相色谱质诺测定条件a) 色谱柱:DB-5MS(30 mXO. 25 mmXO. 25m)石英毛细管柱或相当者sb) 载气z氮气，纯度99.999% , c) 流速:1. 0 mL/min
8、, GB/T 18932.20-2003 d) 柱温初始温度70C.然后以25C/min程序升温至250C.保持5min; e) 进样量:1L，。进样方式z元分流进样gg) 进样口温度:280C , h) 接口温度:280C，。负化学源:150eV，j) 离子源温度:150C , k) 反应气=甲烧，纯度;99.99%, 1) 反应气流量:40%，m) 选择离子检测=检测离子/(m/z)离子比/(%)允许相对偏差/(%)466 100 468 80 士20470 21 土25376 18 土307.4.2 定性测定进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相致，并且在扣除背景后的样品
9、质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子比与标准样品衍生物的离子比相一致，则可判断样品中存在氯霉素。如果不能确证，应重新进样，以扫描方式(有足够灵敏度)或采用增加其他确证离子的方式或用LC-MoMS仪器来确证。7.4.3 定量测定用配制的基质标准工作溶液(4.13)分别进样，绘制峰面积对样品浓度的五点标准工作曲线，仪器测定以m/z466为定量离子，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中氯霉素衍生物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，氯霉素衍生物参考保留时间约为12.3min.氯霉素标准物质衍生物总离子流图和质谱图参见附录A中的图A.1、图A.2.7.5 平行试验以上步
10、骤，对同一试样进行平行试验测定。7.6 空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。B 结果计算结果按式(1)计算gx = c 000 = C. -.一-m 1000 ) l ( . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 式中=X一一试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(fLg/kgl，c 从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)，V一-样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)，m 样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。注:计算结果应扣除空白值。9 精密度本部分的精密度数据是按照GB/T6379
11、的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度GB/T 18932.20-2003 来计算。9.1 重复性在重复性条件下，蜂蜜中氯霉素的含量在0.10g/kg4.。g/kg范围内，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(吟，本部分的重复性限按式(2)计算sr = O. 084 5 m + O. 008 2 ( 2 ) 式中gm 氯霉素测定值的浓度，单位为微克每千克(g/kg)。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2 再现性在再现性条件下，蜂蜜中氯霉素的含量在0.10g/kg4.0g/kg范围内，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)
12、，本部分的再现性限按式(3)计算219R = 0.821 71gm - 0.629 6 .( 3 ) 式中zm一一氯霉素测定值的浓度，单位为微克每千克(g/kg)。GB/T 18932.20-2003 附录A(资料性附最)标准物质衍生物总离子流固和质谱图A.1 氯霉素标准物质衍生物总离子流图，见图A.l。12.34 900 1500 1400 1300 1200 1100 1o 800 000 叩剧团400 300 200 8.50 9.00 9.50 10.00 10.因11.0011. 50 12.00 12.50 13.00 13.50 14.00 t Imi 圈A.1 A.2 氯霉素标
13、准物质衍生物质谱图，见图A.2.466 16。14000 12000 10000 8000 6000 4000 376 2000 2曲246 283 3?4 358 426 74 200 210 220 230 240250 260 270280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380390400 410420430 440 450460470 480 t / min 固A.2GB/T 18932.20-2003 附录B(资料性附录)回收率蜂蜜中氯霉素添加浓度及平均回收率的试验数据z在添加量为0.1g/同时，回收率为77.2%，在添加量为0.3g/同时，回收率为75.4%, 在添加量为1.0g/kg时，回收率为86.8%, 在添加量为4.0g/同时，回收率为82.8%。
