1、GB/T 18932.23-2003 前言GB/T 18932的本部分修改采用加拿大标准ACC-042-Vl. 0.修改的主要内容是:一一淋洗液由甲醇改为乙酸乙酶;一一增加了竣酸型阴离子交换柱净化，一一单四极杆质谱检测器改为串联四极杆质谱检测器。本部分的附录A和附录B为资料性附录。本部分由国家质量监督检验检疫总局提出。本部分由中华全国供销合作总社归口。本部分起草单位g中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.本部分主要起草人=庞国芳、张进杰、曹彦忠、贸光群、范春林、刘永明、李学民、石玉秋。本部分系首次发布的国家标准。I GB/T 18932.23-2003 1 范围蜂蜜中土霉素、囚环素、金霉素、强
2、力霉素残留量的测定方法渣相色谱串联质谱法GB/T 18932的本部分规定了蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量液相色谱串联质谱测定方法P本部分适用于蜂蜜中土霉素、囚环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。本部分的方法检出限z土霉素、四环素为0.001mg/kg;金霉素、强力霉素为O.002 mg/kg, 2 规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注臼期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分
3、。GB/T 6379 测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性(GB/T6379一198日，neqISO 5725 ,1 981) GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T66821992 , neq ISO 3696 , 1987) 3 原理试祥中四环素族抗生素残留，用0.1mol/L Na, EDTA-Mc!lvaine(pH=4. 0土O.05)缓冲溶液提取提取液经离心后，上清液用OasisHLB或相当的固相萃取柱和阴离子交换柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。4 试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的级
4、水。4. 1 甲醇z色谱纯。4.2 乙脯=色谱纯。4.3 乙酸乙酶z色谱纯。4.4 磷酸氢二锅(Na2HPO, 2H，)，优级纯。4.5 拧橡酸(C，H, , H2)。4.6 乙二胶四乙酸二铀(Na，EDTA.2H2)。4. 7 草酸。4.8 磷酸氢二锅溶液，0.2mol/L。称取28.41g磷酸氢二饷(4.4)，用水溶解，定容至1000mL匈4.9 拧橡酸溶液，0.1 mol/L。称取21.01 g拧橡酸(4日，用水浴解，定容至1000 mL, 4. 10 Mcllvaine缓冲溶液:将1000mL O. 1 mol/L拧橡酸溶液(4.的与625mL O. 1 mol/L磷酸氢二纳溶液(4.
5、8)混合，必要时用NaOH或HCI调pH=4.0土0.05，4. 11 Na, EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，0.1 mol/L。称取60.5g乙二胶四乙酸二锅(4.6)放入1625 mL Mcllvaine缓冲溶液(4.10)中，使其溶解，摇匀。1 GB/T 18932.23-2003 4. 12 甲醇+水(1十19)，量取5mL甲醇(4.1)与95mL水混合。4. 13 Oasis HLB固相萃取柱或相当者，500mg, 6 mL.使用前分别用5mL甲喜事和10mL水预处理，保持柱体湿润。4. 14 阴离子交换柱z竣酸型，500mg, 3 mL。使用前用5mL乙酸乙酶预处理，保持柱
6、体湿润。4. 15 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质2纯度注95%。4. 16土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备溶液，0.1mg/mL。准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质(4.15)，分别用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液。储备液贮存在一18C冰柜中。4. 17 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素基质混合标准工作溶液g根据需要吸取适量土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备溶液(4.16)，用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液，基质混合标准工作溶液在4C保存，可使用三天。5 仪器5. 1 液相色谱串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。5.2 分
7、析天平感量。.1mg和O.Olg各一台。5.3 液体混匀器。5.4 固相萃取真空装置。5.5 贮液器，50mL. 5.6 微量注射器，25L，100L。5. 7 刻度样品管，5mL，精度为0.1mL。5.8 真空泵真空度应达到80kPa。5.9 离心管，50mL. 5. 10 平底烧瓶，100mL. 5. 11 pH计s测量精度+0.02.6 试样的制备与保存6. 1 试样的制备对元结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不起过60C的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。6.2 试
8、样保存将试样于常温下保存。7 测定步骤7. 1 提取称取6g试样(精确到O.01 g)置于150mL三角瓶中，加入30mL Na2 EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(4. 11)于液体混匀器上快速混合1min，使试样完全溶解.样液倒入50mL离心管中，以3000 r/min 离心5min，待净化。7.2 净化将上清液(7.1)移至下接OasisHLB柱(4.13)的贮液器中，以小于等于3mL/min通过Oasis固相萃取柱后，用5mL甲醇+水(4.12)洗柱，弃去全部流出液.在65kPa的负压下，减压抽干20min，最后用15mL乙酸乙酶(4.3)洗脱，收集洗脱液于100mL圆底烧瓶中。按
9、上述方法使洗脱液(7.2)在减压情况下以小于等于3mL/min的流速通过阴离子交换柱(4.14), 2 GB/T 18932.23-2003 待洗脱液全部流出后，用5mL甲醇(4.1)洗柱，弃去全部流出液。在65kPa负压下，减压抽干5min, 再用4mL流动相洗脱，收集洗脱液于5mL样品管中，定容至4mL，供液相色谱-串联质谱仪测定.7.3 测定7.3. 1 液相色谱条件a) 色谱柱，InertsilC, -3 , 5m，150 mmX 2.1 mm(i. d)或相当者sb) 流动相z乙脯+甲醇+0.4%甲酸溶液08+4+78), c) 流速，0.2mL/min; d) 柱温，25C，e)
10、进样量，20Lo7.3.2 质谱条件a) 离子源z电喷雾离子源，b) 扫描方式z正离子扫描gc) 检测方式z多反应监测gd) 电喷雾电压:5500 V; e) 雾化气压力:0.055MPa; O 气帘气压力:0.079MPa , g) 辅助气流速:6L/min; h) 离子源温度:430C ; 。去簇电压:55 V , j) 定性离子对、定量离子对和碰撞气能量见表10表1四种四环素族抗生素定性离子对、定量离子对和碰撞气能量抗生素名称定性离于对/(m/z)定量离子对/(m/z)碰撞气能量/V土霉素461/426 461/426 29 461/443 20 461/381 35 四环素445/41
11、0 445/410 28 445/154 40 445/428 20 金霉素479/444 479/444 32 479/154 40 479/462 27 强力霉素445/428 445/428 27 445/410 27 445/154 40 7.3.3 液相色谱串联质谱测定用土霉素、四环素、金霉素、强力霉素基质混合标准工作溶液(4.17)分别进样，以峰离积为纵坐标，工作榕液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准总离子流图参见附录A中的图A.l。在上述色谱
12、条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间见表203 GB/T 18932.23-2003 表2四种囚环素族抗生素参考保留时间抗生章名称保留时间Imn抗生素名称土霉素3.33 金霉素四环素3.89 强力霉素7.4 平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.5 空白试验除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。8 结果计算结果按式(1)计算z式中zX V 1000 =C.-一m 1000 X 试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克(mg/kg); 保留时间/min8.04 12. 07 . ( 1 ) C一一从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(g/m
13、U;V一一一样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL); m一一-样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g).注计算结果应扣除空白值。9 精密度本部分的精密度数据是按照GB/T6379的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算e9. 1 重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限吵，蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素含量范围及重复性方程见表3.如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2 再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R).蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的含量范围及再现性方程见
14、表3.褒3含量范围及重复性和再现性方程名称吉量范围!(mg!kg)重复性限r再现性R土霉素0.002-0.100 Igr=O. 966 81gm-0. 868 6 IgR= 1. 009 61gm-0. 659 7 阳环素0.002-0.100 19r=O. 948 41gm一0.8370 IgR= 1. 161 llgm-O. 231 7 金霉京0.002-0.100 19r= O. 839 51gm- 1. 087 2 IgR =O. 906 Olgm一0.8136 强力霉素0.002-0. 100 Igr=O. 920 91gm一O.846 2 IgR=口.98991g m-O. 650
15、 4 注，m为两次测定结果的算术平均值。4 附录A(资料性附录标准物质总商子流图土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质总离子流图，见图A.L3.89 5000 4500 4闹。3. 8. 07 123 5 11 固A.1 GB/T 18932.23-2003 3.33 min为土霉章3.89 min为四耳章8.04 m皿为盘霉章12.07 min为强力霉章t/min 5 GB/T 18932.23-2003 6 附录B(资料性附录回收率本部分中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B.1. 亵B.l土霉素、四环索、金霉素、强力霉素添加浓度及英平均回收率的试验戴据药物名称添加浓度!Cmg!kg)平均回收率!C%) 0.002 88.0 0.010 95.3 土霉素0.050 93.6 o. 100 95.8 0.002 81. 9 。，白1口82.6 四环素0.050 84.5 o. 100 89.3 0.002 87.2 。01086.0 金霉素86.6 0.050 o. 100 90.8 0.002 85.2 0.010 85.3 强力霉素86.8 0.050 o. 100 87.9
