1、ICS 67.180. 10 X 31 远望中华人民共和国国家标准GB/T 18932.28-2005 蜂蜜中四环素族抗生素残留量测定方法酶联免疫法Method for the determination of tetracyclins antibiotics residues in honey一Enzyme-Iinked immunosorbent assay method 2005-02-04发布2005-08-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局也士中国国家标准化管理委员会也叩前言GB/T 18932的本部分的附录A为资料性附录。本部分由中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局提出
2、。本部分由中华全国供销合作总社归口。本部分起草单位z中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本部分主要起草人z庞国芳、付宝莲、张进杰、肖艳霞。本部分系首次发布的国家标准。GB/T 18932.28-2005 I GB/T 18932.28-2005 1 范围3 原理试样中残留光度值得出试样中4 试剂和材料4. 1.2 4. 1.3 4. 1.4 4. 1. 5 基质。4. 1. 6 显色剂。4. 1. 7 反应停止液。蜂蜜中四环素族抗生素残留量测定方法酶联免疫法4. 2 磷酸二氢铀CNaH2P04 2H20):优级纯。4.3 磷酸氢二锅CNazHP04 12HzO):优级纯。4.4 氯化铀:优级
3、纯。4. 5 吐温20:分析纯。4.6 磷酸盐缓冲溶液:pH=7.4。分别称取0.62g磷酸二氢铀(4.2)、5.73g磷酸氢二铀(4.3)和9g 氯化铀(4.4)于1000 mL中，在pH计上调节溶液pH=7.4。1 GB/T 18932.28-2005 4. 7 洗板溶液:pH=7.2-7. 4。分别称取0.62g磷酸二氢饷(4.2)、5.73g磷酸氢二铀(4.3)和9g氯化铀(4.4)于1000mL中，再细1mL吐温(4.5)，在pH计上调节溶液pH=7.2-7. 4。4.8 四环素族抗生素基质标准工作榕液z根据四环素族抗生素试剂盒(4:1)的线性范围，用空白蜂蜜样品提取液将四环素族抗生
4、素标准潜液(4.1.2)按11.9进行稀释成不同浓度(g/kg)的标准工作溶液。每次测定用的标准工作榕液均应现配现用。4. 9 7.(: GB/T 6682规定的一级水。5 仪器5. 1 酶标仪。5.2 8道移液器:50L-300L。5.3 单道移液器:5L50L，100L1000L和2mL-10 mL。5.4 液体棍匀器。5.5 超声波水浴。5.6 注射过滤器:2mL,._, 5 mL，并带有孔径为0.45m的水相针头式过滤膜。5. 7 具塞试管:10mL, 50 mL 5.8 pH t:测量精度土0.02。6 试样的制备与保存6. 1 试样的制备对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶
5、的实验室样品，在密闭的情况下，置于不超过60.C的水洛中温热、振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温，分出。.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并加以标识。6.2 试样的保存将样品于室温下保存。7 分析步骤7. 1 提取称取1g试样，精确到0.01g，置于50mL具塞试管中，加入10mL磷酸盐缓冲搭被(4.6)于液体棍匀器上快速泪匀1mn，使试样完全榕解。再加入39mL磷酸盐缓冲榕液后，将试管置于超声波水浴中超声5mn，取出摇匀，用注射过撞器将适量的样品榕液过滤至10mL具塞试管中，供酶标仪测定。此溶液稀释系数为50。7.2 测定条件以下所有操作应在20C-24.C室温下进行。7
6、.2. 1 酶标仪测定条件:酶标仪测定波长为450nm。7.2.2 人工洗板条件:洗涤次数五次以上，每次注水量为250L。7.2.3 四环素族试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温(20.C-24.C)后方可使用。7.2.4 将测定需用的微孔板(4.1.1)备齐井插入微孔架上，记录标准及样品等在微孔架上的位置(模板图)。7.3 测定测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。7.3. 1 分别吸取50L四环素族标准工作搭液(4.8)和样品溶液等，按模板图位置依次加入各自的微孔底部。7.3.2 吸取50L四环素族抗体溶液(4.1.3)于每一个微孔底部，然后，用封口膜密封孔口以防榕液挥GB/T 18
7、932.28一2005发。持微孔板在台面上以圆周运动方式棍匀后，于200C24-C避光孵育60min。7.3.3 倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液(但不能使微孔干燥)，然后，立即用洗板溶液(4.7)按7.2.2要求进行洗板。每次弃去洗板溶液后，均应将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干燥。7.3.4 迅速加入100L四环素族酶标记物溶液(4.1.4)于每一个微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于200C240C避光孵育15min。7.3.5 按7.3.3步骤重复操作。7.3.6 迅速加入50L基质(4.1.5)
8、和50L显色剂(4.1.6)于每一个微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于200C240C避光孵育15min。7.3.7 迅速加入100L反应停止液(4.1.7)于每一个微孔底部。然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔架置于酶标仪中，在450nm处测量吸光度(加入反应停止液后应在60min内读取吸光度)。7.4 平行试验按以上步骤，对同一标准、同一样品榕液均应进行平行试验测定。7.5 空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。7.6 监控试验每次测定均应做一个添加四环素族抗生素标准的空白样品。8 结果计算在半对数坐标纸上，以吸光度值为纵坐标(%)，四环素族抗生素标
9、准工作溶液浓度(g/kg)为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的四环素族抗生素浓度后，结果按公式(1)计算zx = c. V 1 000 = c. 一一 -一-一m 1 000 .( 1 ) 式中zx-一一试样中四环素族抗生素残留量，单位为微克每千克(g/kg);C一一从标准工作曲线上得到的试样中四环素族抗生素浓度，单位为微克每千克(g/kg); V一一一样品溶液的体积，单位为毫升(mL);m一一样品溶液所含的试样质量，单位为克(g)。结果表示到小数点后两位。注:计算结果应扣除空白值。9 确证试验如被测样品中四环素族抗生素残留量的值大于检出限时，应用LC-MS-MS法进行
10、确证。10 精密度本部分的精密度数据是按照GB/T6379的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。10. 1 置复性在重复性条件下，蜂蜜中四环素族抗生素的含量在15.00g/kg200.00g/kg范围时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(吵，本部分的重复性限按方程式(2)计算:19 r = 1. 123 9 19 m - 1. 421 3 ( 2 ) 3 GB/T 18932.28-2005 式中zm一一两次测定值的平均值，单位为微克每千克(g/kg)。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。10.2 再现性在再现性条件下，蜂蜜中四
11、环素族抗生素的含量在15.00g/kg-200.00g/kg范围时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性(岛，本部分的再现性限按方程式(3)计算:R = 0.0959 m+ 1. 474 5 . ( 3 ) 式中zm一一-两次测定值的平均值，单位为微克每千克(g/kg)。4 附录A(资料性附录)回收率本方法中四环素族抗生素添加浓度及回收率的试验数据:在添加量为15.00g/kg时，平均回收率为99.0%。在添加量为50.00g/kg时，平均回收率为95.9%。在添加量为100.00g/同时，平均回收率为88.4%。在添加量为200.00g/kg时，平均回收率为107.0%。GB/T 1
12、8932.28-2005 5 mCON-N.NmFH筒。华人民共和国家标准蜂蜜申四环素族抗生素残留量测定方法酶联免擅法GB/丁18932.28-2005国中，峰中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销9峰印张O.75 字数8千字2005年2月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2005年2月第一版定价10.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533 铃书号:155066 1-22375 GB/T 18932.28-2005
