1、lCS 11. 220 B 41 中华人民共和国国家标准GB/T 18935-2003 口蹄疫诊技术Diagnostic techniques for foot-and-mouth disease 2003-01-10发布中华国家质人民共和国督检验检瘟总局2003-05-01实施发布235 GB/T 18935-2003 前言口蹄疫(food-and-mouthdisease，简称FMD)是哺乳动物的命种接触烈件传染病，可引起易感偶蹄兽潜在的严重经济损失。被世界动物E生组织CWorldOrganization for Animal Health(英).Office In ternational
2、 des Epizooties(法).OIEJ列为A类疾病，我国列为类动物疫病。FMD病毒有7个血清型，分别为0、A、c.SATI、SAT2、SAT3和Asial。本病l临床上表现为口、舌、唇、鼻、蹄、乳房等部位发盐水泡、破溃形成烂斑。FMD在临床上不易与其他水泡性疾病(猪水泡病、水泡性殇和水泡性口炎)区别。本标准的诊断方法参考。IE(诊断试验和疫苗标准手册以2000版)的推荐方法，并结合我国有关动物防疫法，以及相关政策和法规制定的。在技术上与国际先进技术保持一致。其中病毒中和试验、液相阻断酶联免疫吸附试验是国际贸易指定试验。本标准的附录A、附录B和附录C是规范性附录。本标准由中华人民共和国农
3、业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人2朱彩珠、卢永干。236 GB/T 18935-2003 口蹄瘦诊断技术1 范围本标准规定了口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus, FMDV)的微量补体结合试验、食道探杯杳毒试验、反转录聚合前链反应(RT-PC酌，病毒中和试验、液相阻断-酶联免疫吸附试验、病毒感染相关抗原(VIA)琼脂凝胶免疫扩散(AGID)试验的技术要求。本标准所规定的试验技术适用于检测各种不同样品中的口蹄疫病毒抗原或抗体。2 微量补体结合试验2. 1 材料2. 1. 1 样晶采集和抗
4、原制备2.1. 1. 1 样品的采集、保存和运送的方法和要求见附录A。2.1.1.2 抗原制备g在无菌室内将水泡皮或乳鼠朋体用磷酸盐缓冲液(PBS)洗净，用灭菌滤纸吸干后称重。放在灭菌研钵中先剪碎，后加灭菌石英砂研磨。加磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7. 4)制成1 4悬液。水泡液也以PBS作1 4稀释，可与组织悬液合并。室温浸毒2h以上，或4(;冰箱过夜。3000 r/min离心10min。分离出上消液;58.C水浴灭活40min。再3000 r/min离心10min。取上清液为待检抗原。2. 1. 2 抗体口蹄疫病毒0、A和亚洲-1型，及猪水泡病病毒(SVOV)豚鼠高免血清。2. 1. 3
5、补体健康成年公豚鼠新鲜血清。加保存液(Richardson液)后，可4.C保存6个月。使用前滴定效价。2. 1. 4 溶血素兔抗绵羊红细胞抗血清，使用前滴定效价。2. 1. 5 红细胞成年健康绵羊红血球。试验当天制备2.8%工作液和敏化红细胞。2. 1. 6 主要仪器和器材j, U形底96孔微量滴定板，微量可调移液器及配套尖头，转头经改装可插入微量板的离心机，光电比色汁。2. 1. 7 缓冲液配制方法(见附最B)2.2 预备试验2.2.12.8%红细胞悬液的制备将脱纤的(绵羊)红细胞用VBO洗涤3次。每次加5倍于红细胞体积的VBO轻摇混匀，1 500 r/min离心10min。吸去上消液后再加
6、入VBO.反复3次。最后吸取2.8mL红细胞泥加入盛有97.2 mL VBO的三角瓶中，充分混匀。取0.5mL红细胞悬液，加4.5mL蒸惰水。对照管加5mL蒸馆水。用波长625nm滤光片的光电比色计测定该初配制的红细胞悬液的00值。按标准2.8%红细胞悬液的标准。D值=42.用式(1)校正该初配红细胞悬液的浓度。一初配红细胞悬液用VBO量(mL)豆豆篮1训日缓冲液的总数(mL)标准00值(42)工土里x( 1 ) 237 GB/T 18935-2003 例如初配红细胞悬液100mL测定。D值二45(大于标准值42)。按公式计算97.2X45742=104.104-97. 2=6. 8.即应补加
7、6.8mL缓冲液于红细胞悬液中，再测。D值将符合标准值42。若初配红细胞悬液的00值小于42.可将该红细胞悬液离心，根据式(1)计算取出多余的缓冲液，再测00值。2.2.2 0%-100%溶血标准孔按如下方法制备2.2.2.1 血红素:取1mL2.8%红细胞悬液，加7mL蒸饱水，充分摇动直到红细胞全部溶解。再加2 mL VB.混匀。2.2.2.20.28%红细胞=取1mL 2. 8%红细胞悬液，加9mL VBO.混匀。亵1标准溶血百分比单位为微升孔位A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 All 血红章。20 40 60 80 100 120 140 160 180 20
8、0 0.28%红细胞200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 。溶血百分比。10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2.2.2.3 溶血标准孔的制备z按表1所列剂量将血红素和红细胞悬液加入微量板AlAll各孔。1 000 r/min离心10mino A6孔为50%溶血孔，其红细胞沉淀图形的大小和溶血颜色深浅 6.2.5 将50L的血清/抗原混合物转移到兔血清包被的ELlSA板中，置37C孵育1h. 6.2.6 洗板同6.2. 3. 6.2.7 每孔漓加50L前一步使用的同型病毒抗原的豚鼠抗血清，置37C孵育1h。62.8 洗板每孔加50L酶结
9、合物，置37C孵育1h。6.2.9 再洗扳:每孔加50L含0.05%H，O，(3%质量浓度)的邻苯二胶。6.2 10 加50L1. 25 mol/L硫酸中止反应，15min后，将板置于分光光度计上，在492nm波长条件下读取光吸收值。6. 2. 11 每次试验时，设立强阳性、弱用性和1 32牛标准血清以及没有血清的稀释flj抗原对照孔，阴性血清对照孔。6. 3 结果判定抗体滴度以50%终滴度表示，即该稀释度50%孔的抑制率大于抗原对照孔抑制率均数的50%。淌度大于1 40为阳性，滴度接近1, 40应用病毒中和试验重检。245 GB/T 18935-2003 7 病毒感染相关(VIA)抗原琼脂凝
10、胶免疲扩散试验(VIA-AGID)7. 1 材料7. 1 1 血清样品的采集和处理见附录A。7. 1. 2 VIA抗原。7. 1. 3 VIA抗体阳性(对照)血清。7 1. 4 缓冲液O. 02 mol/L Tris-O. 15 mol/L氯化销(pH7.6) Tris 2. 42 g 氯化销(NaCll3. 80 g 蒸馆水1 000.0 mL用浓盐酸调整pH为7.6. 7. 1. 5 模板z用有机玻璃板制作。本试验设计了两种不同孔数的模板(图和图2所示).1型由1个中央孔和6个均匀分布的周边孔组成，孔径和孔间距均为4mm. II型为适应大批量检测需要设计的，由4组I型模板组成。 。.。 抗
11、国孔$0 阳性对照孔e一待检样品孔图11型模板7. 1. 6 打孔器:与模板配套制作的，外径为4mm的不锈钢管。7 1. 7 平皿:常用直径6cm的平皿，要求底面平整光滑。7 2 试验操作7. 2. 1 琼脂糖凝胶板的制备 .II. .II. 抗国孔30一一阳性对照孔g 持撞样品孔图2n型模板称取1.0g琼脂糖(电泳用)，置于150mL容量的三角烧瓶中，再加入100时，缓冲液。将三角烧瓶置于磁力搅拌器上，边搅拌边加热至沸腾使琼脂糖完全熔化。将熔化的琼脂糖溶液注入平皿中，每个平皿加8mL，凝胶板厚约3mm。待自然冷却凝固后，盖好平皿l后倒置放在湿盒中，4C冰箱保存。7. 2. 2 打孔按检测样品
12、的数量选用模板。揭开平皿，将模板放在凝胶板上方，打孔器垂直插入模板孔中并穿透凝胶直至底丽。打完孔后拿开模板，用细针头轻轻挑出孔中的凝胶块，将平皿底部在酒精灯上略烤封底。7.2.3 加样用微量移液器每孔加样20L.抗原孔(中央孔)加VIA抗原It照孔(1型中央孔左、右侧的2个周边孔.II型2个中央孔之间的孔)加VIA阳性对照血清，其余各孔(1型4孔/板.U型20于LI板)加待246 GB/T 18935-2003 检血清样品。7.2.4 扩敝加完样后盖上平皿，放入湿盒中。置于室温15C25C任其扩散。7.3 结果判定7. 3. 1 加样后24h开始观察，每天观察并记录，至120h时判定结果。当阳
13、性对照与抗原孔之间出现清晰沉淀线时，如图1和图2中所示，本试验成止。7.3.2 待检血清与抗原孔之间出现沉淀线，并与阳性对照沉淀线末端相融，如图1中1孔，该血清判定为阳性.7.3.3 待检血清与抗原孔之间虽然未出现沉淀线，但阳性对照沉淀线的末端弯向待检血清孔，如图1中3孔，该血清判定为弱阳性.7.3.4 待检血清与抗原孔之间未出现沉淀线，如图1中2和4孔，该血清判定为阴性。7.3.5 血清孔之间出现的沉淀线，为非特异性反应。247 GB/T 18935-2003 附录A(规范性附景)水泡性疾病诊断梓晶的采集、保存和运送A. 1 样晶的采集和保存A. 1. 1 组织样晶A. 1. 1. 1 样晶
14、的选择用于病毒分离、鉴定的样品以发病动物(牛、羊或猪)未破裂的舌面或蹄部、鼻镜、乳头等部位的水泡皮和水泡液最好。对临床健康但怀疑带毒的动物可在屠宰后采集组织样品如淋巴结、脊髓、肌肉等作为检测材料。A 1 1.2 样晶的采集和保存A1.1.2.1 未破裂水泡中的水泡液用灭菌注射器吸出后装入灭菌小瓶中(可加适量抗商素), JJP盖并用胶带封口，严防进水，4C8C冷藏。A 1.1.2.2 剪取新鲜水泡皮放入灭菌小瓶中，加适量50%甘油一磷酸盐缓冲液(pH7.4)，加塞塞紧并用胶带封口，-30C以下保存。A 1 1 2. 3 在屠宰时采集组织样品3g5g装人洁净的食品塑料袋内，用封口机封口或结扎紧袋口
15、后立即放人盛有冰块的保温瓶(箱)内。然后尽快送往-30C冰箱中冷冻保存。每份样品的包装瓶(袋)上均要贴上标签，写明采集地点、动物种类，编号，时间等。A. 1. 2 牛、羊食遭-咽部分泌物(0-p液)样晶A.1.2.1 样晶的采集被检动物在采样前禁食(可饮水)12h，以免反驾胃内容物严重污染o-p液。采样用的特制探杯(probang cup)在使用前经0.2%拧橡酸或2%氢氧化纳浸泡，再用自来水冲洗。每采完一头动物，探杯都要重复进行消毒和清洗。采样时动物站立保定，操作者左手打开牛口腔，右手握探杯，随吞咽动作将探杯送入食道上部10cm15 cm处，轻轻来回移动2次3次，然后将探杯拉出。如采集的o-
16、p液被反当胃内容物严重污染，要用生理盐水或自来水冲洗口腔后重新采样。A. 1. 2. 2 样晶的保存在采样现场将采集到的8mL10 mL o-P液倒入容量25mL以上，事先加有8ml.10 mL细胞培养维持液，或0.04mol/L PB , (pH7. 4)的灭菌容器如广口瓶，细胞培养瓶或大试管中。加盖翻口胶塞后充分摇匀。贴上防水标签，并写明样品编号、采集地点、动物种类、时间等，尽快放入装有冰块的冷藏箱内。然后转往-60C冰箱保存。A. 1. 3 血清无菌操作采集动物血，每头不少于10mL.自然凝周后无菌分离血清装入灭菌小瓶中，可加适量抗菌素，加盖密封后冷藏保存。每瓶贴标签并写明样品编号、采集
17、地点、动物种类、时间等。A.2 样晶的运送将封装和贴上标签，已预冷或预冰冻的样品装入冰瓶或保温泡沫塑料盒内，同时加放30C预冰冻的保冷剂和适当的填充材料，再加盖密封。包装盒上注明小心?!易碎易变质生物材料，途中不许打开;无商业价值。以最快方式，派专人送到或航寄到农业部指定的单位。样品需写明送样单位名称和联系人姓名、联系地址、邮编、电话及电传号码等.送检材料应附有详细说明，包括采样时间、地点、动物种类、样品名称、数量、保存方式及有关疫病发生流行情况和临床症状等。248 附录B(规范性附录)缓冲液的配制B. 1 巴比妥锅缓;中盐水(VeronalBuffer. VB，5倍浓缩液)巴比妥酸巴比妥纳氯
18、化纳(NaCIl氯化钙(CaCI2) 5.75 g 3.75 g 85.0 g 0.28 g 氯化键(6H，O)(MgCl，. 6H20l 1.g 蒸f留水(dH2()2 000 mL GB/T 18935-2003 先将巴比妥酸溶于500mL加热至梯的蒸惰水中。冷却后加入其他成分，加蒸馈水至2000mL.充分混匀。分装人带塞的瓶中.103kPa蒸汽灭菌15min塞紧瓶塞.4C保存。B.2 微量补体结合试验缓冲液(VBD.Veronal Buffer工作液)巴比妥纳缓冲盐水(VB.5倍浓缩液)10Q mL 蒸馆水(dH，O)400 mL 用碳酸氢纳调整pH至7.4。试验当天现配现用。B.3 补
19、体保存液(Richardson液)A液:蹦酸(H，BO，) 棚砂(Na，队0， H2o) O. 93 g 2.29 g 山梨醇11. 47 g 加饱和氯化销溶液至100mL 昆匀，室温保存。B液z棚砂(Na2B，O， H, O) 0.75 g 叠氮纳(NaN，)0.81 g 加饱和氯化饷溶液至100mL 昆匀。室温保存。使用方法，8份豚鼠血清加l份A液、1份B液，混匀后置4C可保存6个月。用补体时，取I份保存补体加7份蒸馆水.&PJ:l0稀释补体。249 GBjT 18935-2003 C1 PBS(硝酸盐缓冲液的配制C 1. 1 O. 1 mol/L PBS 氯化锅(NaCl)氯化梆(KCl
20、l磷酸氢二纳(Na，HP，.12H20) 磷酸二氢梆(KH2PO，) 蒸饱水(dH，()C 1.2 0.04 mol/L PBS(pH7. 2-7. 4) 附录C(规范性附录)试剂的配制80.0 g 2.0 g 30.0 g 2.0 g 1 000.0 mL O. J mol/L PBS 400 mL 蒸馆水(dH2)600 mL 103 kPa高压蒸汽灭菌30mno室温或4C冰箱保存.C 1.3 50%甘I1l-PBS(pH7.4)O. 04 mol/ L PBS与纯甘泊(A.R. )等量混和，调正pH至7.4.分装成小瓶.103 kPa高压蒸汽灭茵30m1no室温或4C冰箱保存。C. 2
21、ELISA缓冲液、试剂C 2.1 0.05 mol/L Na, CO, -NaHCO, , pH9. 6(包被缓冲液)A液z碳酸纳(Na，CO，) 蒸锢水(dH，()B液z碳酸氢俐(NaHC3) 1. 68 g 400.0 mL 2.86 g 蒸馆水(dH，() 200. 0 mL 400 mL A液与150rnL左右B液混合，调整pH至9.6. C 2. 2 稀释液A0.1 mol/L PBS 蒸馆水(dH，) 吐温20C 2. 3 3 3 mmol/L OPD(邻苯二胶)OPD 拧橡酸-PB50 mL 450 mL 0.25 mL O. 1 g 200 mL 在暗室中操作，溶解后分装6mL
22、/瓶，-20C保存。C 2. 4 拧槽戳-PB(pH5.0)拧橡酸(H，O)磷酸氢二锅(Na，HPO, 12H,() 蒸馆水(dH，() 250 2.6 g 9.2 g 500. 0 mL C. 3 细胞培养液C. 3. 1 Eagle-MEM(最低眼度必须氨基酸营养液)10XEagle-MEM营养液Eagle-MEM营养剂9.5 g 蒸馆水(dH2)100.0 mL GB/T 18935-2003 溶解后滤过除菌。将双蒸馆水103kPa高压灭菌30min，然后将滤过的营养液按1 10，即100mL 营养液加入900mL灭菌蒸馆水中。室温保存。C. 3. 2 0.5%水解乳白蛋白/Earle液
23、氯化纳(NaCD氯化梆(KCD氯化钙(CaCI2) 硫酸筷(MgS，. 7 H2 ) 磷酸二氢纳(NaH2P，) H2 葡萄糖10%盼虹水解乳白蛋白加双蒸水(ddH，)至1000.0 mL 6.8 g 0.4 g 0.2 g 0.2 g O. 14 g 1. 0 g 2.0 mL 5.0 g 按配方称取各成分并逐个溶解，最后加双蒸水至1000 mLo过滤除菌，或69kPa高压蒸汽灭菌15 min。室温或4C保存。C. 3. 3 细胞维持液Eagle-MEM营养液50 mL 0.5%水解乳白蛋白/Earle液50 mL 5%碳酸氧铀(NaHCO，)调整pH至7.67. 8。c. 3. 4 细胞营养液Eagle一MEM营养液0.5%水解乳白蛋白/Earle液楼牛血清45 mL 45 mL 10 mL 5%碳酸氢销(NaHC，)调整pH至7.27. 4。251
