1、ICS 67.050 X 04 中华人民共和国国家标准GB/T 18979-2003 食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法Determination aflatoxins content in food Cleanup by immunoaffinity chromatogaphy and determination by high-performance liquid chromatigraphy and f1 uorometer 2003-02-21发布2003-08-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检菇总局G/T 18979 2003 前言本标准由北
2、京市质量技术监督局提出。本标准由全国食品工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:北京市产品质量监督检验所、青岛出入境检验检疫局、国家标准物质研究中心。本标准主要起草人z王晶、张鹏、张艺兵、邵明武。本标准为首次发布。1 范围食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法GB/T 18979-2003 本标准规定了免疫亲和层析净化高效液相色谱法和免疫亲和层析净化荧光光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。本标准适用于玉米、花生及其制品(花生酱、花生仁、花生米)、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。样品中黄曲霉毒素的检出限2免疫亲和层析净化一高效液相
3、色谱法测定黄曲霉毒素Bl以及黄曲霉毒素Bl、B，、G1、G2总量检出限为1g/kg，免疫亲和层析净化荧光光度法测定黄曲霉毒素Bl、B，、G1、G，总量检出限为1g/峙，酱油样品中检出限为2.5问/kg，2 免瘦亲和层析净化高效液相色谱法2.1 方法提要试样经过甲醇水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素Bl、B，、G1、G，具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水或吐温-20/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后确溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。2.2 试剂和溶
4、液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馆水。2.2.1 甲蹲(CH，OH):色谱纯。2.2.2 甲醇水(7+3):取70mL甲醇加30mL水。2.2.3 甲醇水(8+2):取80mL甲醇加20mL水。2.2.4 甲醇水(45+5日取45mL申醇加55mL水，2.2.5 苯z色谱纯。2.2.6 乙腊g色谱纯。2.2.7 苯-乙腊(98+2):取2mL乙脯加98mL苯。2.2.8 氯化饷(NaCl)。2.2.9 磷酸氢二纳(Na，HPO.)，2.2.10 磷酸二氢饵(KH，PO.)。2.2.11 氯化饵(KCD。2.2.12 PBS缓冲溶液s称取8.0g氯化俐，. 2 g磷酸氢二锅，0.2g磷酸二
5、氢饵，0.2g氯化饵，用990 mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.O.最后用纯水稀释至1000 mL。2.2.13 吐温20/PBS溶液(0.1%):取1mL吐温20.加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。2.2. 14 pH7.0磷酸盐缓冲溶液=取25.0 mL O. 2 mol/L的磷酸二氢惆溶液与29.1 mL O. 1 mol/L的氢氧化纳溶液混匀后，稀释到100mL。GB/T 18979-2003 2.2.15 黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素矶、B2、G1、G2)，纯度:;?99%。2.2.16 黄曲霉毒素标准储备溶液g用苯-乙腊(98+2)溶液分别配制0.100mg/mL的
6、黄曲霉毒素B，、民、G1、G2标准储备液，保存于4C备用。2.2.17 黄曲霉毒素混合标准工作液z准确移取适量的黄曲霉毒素B，、民、G1、G2标准储备液，用苯-乙脯(98+2)溶液稀释成混合标准工作液。2.2.18 柱后衍生溶液(0.05%腆溶液)，称取0.1g腆，溶解于20mL甲醇后，加纯水定容至200mL. 以0.45m的尼龙滤膜过滤.4c避光保存。2.3 仪器和设备实验室常规仪器、设备及下列各项。2.3.1 高速均质器，18000 r/min22 000 r/mino 2.3.2 黄曲霉毒素免疫亲和柱。2.3.3 玻璃纤维滤纸:直径11cm.孔径1.5mo2.3.4 玻璃注射器，10mL
7、.20 mLo 2.3.5 玻璃试管z直径12mm，长75mm，元荧光特性。2.3.6 高效液相色谱仪z具有360nm激发波长和大于420nm发射波长的荧光检测器。2.3.7 空气压力泵。2.3.8 微量注射器，100Lo2.3.9 色谱柱C18柱(柱长150mm.内径4.6mm，填料直径5m)。2.4 分析步骤2.4.1 提取2.4. 1. 1 大米、玉米、小麦、花生及其制品s准确称取经过磨细(粒度小于2mm)的试样25.0g于250 mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化销及甲醇-水(7+3)至125.0mL(V，).以均质器高速搅拌提取2 mino定量滤纸过滤，准确移取15.0mL(V2)滤
8、液并加人30.0mL(V3)水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤12次，至滤液澄清，备用。2.4. 1. 2 植物油脂=准确称取试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化纳及加入甲醇水(7+3)至125.0mL(V，).以均质器高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，准确移取15.0mL(V2)滤液并加入30.0mL(V3)水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤12次，至滤液澄清，备用。2.4.1.3酱油=准确称取试样50.0g于250.0mL具塞锥形瓶中，加人2.5g氯化纳及加入甲醇水(8十2)至100.0 mL(V,) 以均质器高速搅拌提取1minc定量滤纸过滤，准确移取10.0mL(V2)滤液并加人
9、40.0mL(V3)水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤12次，至滤液澄清，备用。2.4. 1. 4 食醋z准确称取5.0g样品，加人1.0g氯化锅，以pH7.0磷酸盐缓冲溶液稀释至25.0mL (V1).混匀，定量滤纸过滤。取10.0mL(V2)滤液加入10.0mL(V3)缓冲液，混匀，以玻璃纤维滤纸过滤12次，至滤液澄清，备用。2.4.2 净化2.4.2.1 大米、玉米、小麦、花生及其制品、植物油脂z将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确移取15.0mL(只样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2mL3 mL空
10、气通过柱体。以10mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2mL3 mL空气通过柱体。准确加入1.0 mL(V)色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min2 mL/min.收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。2.4.2.2 酱油=将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL(只)酱油样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱。用10mL O. 1%的吐温20/PBS清洗，再以10mL水清洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2mL3 mL空气通过柱体。准确加入1.0 mL(V)色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min2
11、 mL/min. GB/T 18979-2003 收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。2.4.2.3 食醋将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL(V.)食醋样品提取液注人玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，用10mLO.l%的吐温20/PBS溶液清洗，再以10mL水清洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2mL3 mL空气通过柱体。准确加入1.0 mL(V)色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min 2 mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。2.4.3 测定2.4.3.1 高效液相色谱条件流动相甲醇-
12、水(45+55)流速，0.8mL/min 柱后衍生化系统衍生溶液，0.05%腆溶液衍生溶液流速0.2mL/min 反应管温度，70C反应时间:1min 2.4.3.2 定量用进样器吸取100L黄曲霉毒素混合标准工作液(2.2.17)注人高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值峰高或峰面积)，得到黄曲霉毒素B，、B2、G，、G，标准溶液高效液相色谱图。参考谱图见图1。dHR傲骨量相-D幅酣酣雹辄NO瞩钳酣哥牺值回国MMUM8应响8 保自时间Imin图1黄曲霉毒素B，、B，、G，、G，的标准谱图取样品洗脱液1.0 mL加入重蒸馆水定容至2.0mL，用进样器吸取100L注入高效液相色谱仪
13、，在上述色谱条件下测定试样的响应值(峰高或峰面积)。经过与黄曲霉毒素标准溶液谱图比较响应值得到试样中黄曲霉毒素B，、岛、G，和仇的浓度c。2.4今4空白试验用水代替试样，按2.4. 12. 4. 3步骤做空白试验。2.4.5 结果计算样品中黄曲霉毒素B，、B，、G，或G2的含量(X，)以微克每千克表示，按式(1)计算s.( 1) X , 豆豆4二Vw GB/T 18979-2003 其中2V X -V V叫一十一V m一叭W ( 2 ) 式中zX, 样品中黄曲霉毒素B，、B2、G，或G2的含量，单位为微克每千克(g/kg), C, 试样中黄曲霉毒素B，.B，.G，或G，的含量，单位为微克每升(
14、fLg/L), Co一二空白试验黄曲霉毒素B，、B，、G，或G2的含量，单位为微克每升(g/L), V一最终甲醇洗脱液体积，单位为毫升(mL)，W 最终净化洗脱液所含的试样质量，单位为克(g), m 试样称取的质量的数值，单位为克(g)，V , 样品和提取液总体积，单位为毫升(mL)，V , 稀释用样品滤液体积，单位为毫升(mL)，V3 稀释液体积，单位为毫升(mL)，V，一通过亲和柱的样品提取液体积，单位为毫升(mL)，黄曲霉毒素总量为B，、B，、G，、岛的浓度之和，即B，+ B, +G, +G，。计算结果表示到小数点后两位。3 免疫亲和层析净化荧光光度法3.1 方法提要试样经过甲醇水提取，
15、提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B，、B，、G，、G，具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，加入澳溶液衍生，以提高测定灵敏度。洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素(B，十B，+G，十G，)总量。3.2 试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馆水。3.2.1 甲醇(CH30H)，色谱纯。3.2.2 甲醇水(7+3)，取70mL甲醇加30mL水。3.2.3 甲醇水(8+2)，取80mL甲醇加20mL水。3.2.4 氯化锅(NaCl)。3.2.5 磷酸氢二销(Na2HP
16、O.)，3.2.6 磷酸二氢梆(KH，PO，)。32.7 氯化御(KC)。3.2.8 澳溶液储备液(0.01%)称取适量澳，溶于水，配成0.01%的储备液，4C避光保存。3.2.9 澳溶液工作液(0.002%)，取10mL O. 01%的澳溶液加入40mL水混匀，于棕色瓶中保存备用。需每次使用前配制。3.2.10 二水硫酸奎宁(C20HN，O， H 2 SO, .2H，O)。3.2.11 硫酸溶液(0.05mol/L)取2.8mL浓硫酸，缓慢加入适量水中，冷却后定容至1000mL, 3.2.12 荧光光度计校准溶液.称取3.40g硫酸奎宁(C20HN，O， H, SO, .2H，O)用0.05
17、mol/L硫酸溶液稀释至100mL，此溶液荧光光度计读数相当于20s/L黄曲霉毒素标准溶液。3.3 仪器和设备实验室常规仪器、设备及下列各项。3.3.1 荧光光度计。3.3.2 高速均质器，18000 r/min-22 000 r/min, GB/T 18979-2003 3.3.3 黄曲霉毒素免疫亲和柱。3.3.4 玻璃纤维滤纸:直径11cm，孔径1.5mo3.3.5 玻璃注射器，10mL, 20 mL 3.3.6 玻璃试管:直径12mm，长75mm，无荧光特性。3.3.7 空气压力泵。3.4 分析步骤3.4.1 提取同2.4.1。3.4.2 净化同2.4.2。3.4.3 测定3.4.3.1
18、 荧光光度计校准在激发波长360nm，发射波长450nm条件下，以0.05mol/L硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数值为0.0吨/L，以荧光光度计校准溶液(3.2.12)调节荧光光度计的读数值为20.0g/Lo3.4.3.2 样液测定取上述净化后的甲醇洗脱液加入1.0 mL O. 002%澳溶液，混匀，静置1min，按3.4.3.1条件进行操作，于荧光光度计中读取样液中黄曲霉毒素(B1+B，十G，+G2)的浓度c(g/L)。3. 4. 4 空白试验用水代替试样，按3.4. 13. 4. 3步骤做空白试验。3.4.5 结果计算样品中黄曲霉毒素(B1十B2+G1十G，)的含量(Xz)以微克每千
19、克表示，按式(3)计算:X , (C2 - c,) V 一w .( 3 ) 其中V -V V门-+一V m-K W .( 4 ) 式中X2 样品中黄曲霉毒素(B1十B2十G，十G2)含量.单位为微克每千克(g/kg), C2试样中黄曲霉毒素(B1+Bz+G1十Gz)的含量，单位为微克每升(g/L), c，一一空白试验黄曲霉毒素(B1+B2+G1十G2)的含量，单位为微克每升(g/L), V一二最终甲醇洗脱液体积，单位为毫升(mL)，W一二最终净化洗脱液所含的试样质量，单位为克(g), m一二i式样称取的质量的数值，单位为克(g)，v1 样品和提取液总体积，单位为毫升(mL)，飞(11一一稀释用样品滤液体积，单位为毫升(mL)，v, 稀释液体积，单位为毫升(mL)，v，一一通过亲和柱的样品提取液体积，单位为毫升(mL)。计算结果表示到小数点后一位。
