1、a亘中华人民共和国国家标准GBT 23239-2009伊氏锥虫病诊断技术Diagnostic techniques for Trypanosomosis evansi2009-03-09发布 20090501实施宰瞀髁鬻瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会议1”刖 置(mT 23239-2009本标准的制定参照了世界动物卫生组织(OIE)编写的陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)(第五版，2004)。本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院上海兽医研究所。本标准主要起草
2、人：周金林、沈杰。伊氏锥虫病诊断技术GBT 23239-20091范围本标准规定了新鲜血片、薄血涂片染色、毛细管集虫、实验动物接种等病原鉴定方法和乳胶凝集试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验等血清学试验技术。本标准适用于伊氏锥虫病的诊断、检疫、流行病学调查。2临床诊断依家畜种类不同，临床症状表现不同。马(骡、驴)一般呈急性经过，感染后，体温突然升高到40以上，稽留数El，而后经短时间的间隙，再行发作，体表水肿为常见症状，结膜和第三眼睑常有出血斑。黄牛、水牛及骆驼等一般呈慢性经过，有不定期的间歇发热，食欲不振，消瘦，肿脚和耳、尾于枯症状，许多慢性感染病例无明显病变。有以上临床症状者，可以怀疑感染
3、，确诊需要实验室检验。3病原鉴定31采血样可从耳静脉或尾静脉采取外周血，从颈静脉或其他大静脉采取深部血液，因伊氏锥虫喜欢寄生于深部血液，处于低虫血症时，外周血检出率常低于深部血的50。32新鲜血片检查在干净载玻片上滴上一小滴鲜血，盖上盖玻片，使血液扩散成为细胞单层，再用光学显微镜(200倍)观察活动锥虫。为防止血液在观察时干涸，也可先在载玻片滴血时加一滴生理盐水或3柠檬酸三钠生理盐水。33薄血膜染色检查将-d,滴血放在清洁载玻片一端约20 mm处，按常用方法推成薄血膜，迅速风干，用甲醇固定2 rain，干燥后，再加姬氏染色液(配法参见附录A)染色25 rain，倾去染色液，自来水冲洗，干燥后用
4、400倍1 000倍显微镜检查。34毛细管集虫检查341材料准备肝素处理过的毛细管(管内径15 mm，长75 mm的玻璃或无色透明的硬质塑料管，在拟进血的一端吸人3肝素钠10 mm，用烤箱7080烤干后备用)，显微镜一台，离心机一台，载玻片，盖玻片，12号以上注射针头(或金属针)，塑泥(橡皮泥)。342采集待检血样从动物耳静脉或尾静脉穿刺获得血液。先用酒精棉擦净拟采血处皮肤，干后用针头穿刺血管，血流出时用毛细管吸人达40 mm深(即70 pL血)，封闭未沾染血的另一端(可用塑泥或火焰加热封闭)。343集虫以3 0009离心10 rain，待红细胞全部沉积于毛细管下半部，上层为黄色血浆时即可。3
5、44检查在毛细管的血浆与红细胞分界线下1 mm处将管折断(切断、剪断)，将带有少量红细胞的血浆滴于载玻片上，盖上盖玻片，使血液扩散成细胞单层。在350倍400倍放大的光学显微镜下检查活锥虫，如需进一步详细观察虫体，可再除去盖玻片，晾干血片后，用姬氏染色液染色后，在800倍1 500倍放大的显微镜下观察确定。GBT 23239-200935动物接种采被检动物血025 mL，加入灭菌阿氏液(或3柠檬酸三钠生理盐水)025 mL，经腹腔注射人小白鼠(大白鼠则加倍量)，每周3次从尾部采血检查活寄生虫，为提高锥虫在小鼠体内培养繁殖的敏感性，可用环磷酰胺或醋酸氢化可的松抑制小白鼠的免疫力。4血清学试验41
6、乳胶凝集试验411材料准备4111器材碍L胶凝集试验反应板，为具黑色背景的玻璃板，用漆或油性色笔将板面分成(20 mm30 ram)(20 mm30 ram)的方格若干个。25止移液器(或5 pL200 pL可调移液器)或滴管。具凹井的有机玻璃(或玻璃)血凝反应板。4112试剂：化学交联锥虫抗原的乳胶诊断液，锥虫病阳性血清和阴性血清，生理盐水。412分析步骤4121用移液器或滴管将生理盐水对被检血清、阳性血清和阴性血清作1：40稀释。4122用滴管在乳胶凝集试验反应板上各方格中分别滴人已被稀释的血清一滴。4123在各方格血清中分别加入同样量的乳胶诊断液，轻轻摇匀，8 rain内观察结果，室温低
7、于10时需延长2 min3 rain观察，高于30时需提前2 min3 rain观察。413结果判定反应液由均匀白色改变为整个液体清亮，并有细小白色凝集颗粒分散其中者为阳性，如仍为均匀白色则为阴性。如阳性血清未出现阳性反应，或阴性血清出现阳性反应属操作有误或器材准备不合格，需重做。42间接血凝试验421材料准备4211器材：V形(90。角)微量血凝板，10 pL、50 pL及i00 pL移液器，温箱。4212试剂：锥虫病问接血凝诊断液，包含抗原致敏血球悬液和非致敏血球悬液；阳性血清或阳性干燥血纸；磷酸缓冲液(PBS配法参见附录B)。422分析步骤4221先在血凝板写上血清或血纸编号，每份血清取
8、2排各6个孔，上排作测定排，下排为对照排。4222于左边每上排第1孔内加缓冲液200 pL和血清50zL(5倍稀释)，如用血纸则剪取12 cm2血纸剪碎，加缓冲液200 pL，其浸出液相当血清20倍稀释。然后从每排第2孔开始每孔加入缓冲液50 pL。4223从第1孔内吸取已稀释的血清或血纸浸出液50止加入第2孔内，再向右按次序作倍比稀释，共稀释到160倍(血清)或640倍(血纸)。并吸取第1孔内液50 pL加入第2排第2孔内，按同样方法向右作倍比稀释。最后孔中吸取50 pL稀释液丢弃。4224向测定排第2孔至第6孔中各加入致敏血球悬液10 pL，向对照排第2孔至第6孔中各加入非致敏血球悬液10
9、 pL(如表1)。表1血清稀释倍数血清号5 10 20 40 80 160 320 640测定1对照测定2对照表1(续)GBT 23239-2009血清稀释倍数血清号5 10 20 40 80 160 320 640测定3对照测定4对照测定5对照测定 阴性血清 阴性血清6对照 缓冲液 缓冲液4225阳性血清也按上述方法操作，另设仅加缓冲液50 pL的空白对照孔2个，分别加入致敏和非致敏血球悬液10 pL。4226用微型血凝板振荡器或手指轻拍，将血液悬液与血清稀释液混匀。置于2630条件下1 h2 h有一小红色圆点，周围为淡红色毛玻璃状，为阳性，记录为“+”。红血球大部分沉于孔底中央，图像为孔底
10、中央有一较大红色圆点，周围有少量面积的淡红色，为弱阳性，记录为“+”。红血球全部沉于孔底中央，图像为孔底中央有一大的红色圆点，周围液体清亮，无淡红色，为阴性，记录为“一”。423结果判定凡测定排阳性反应孔不到1：80稀释时判为阴性，1：80稀释孔及其以上为阳性反应，且测定排比对照排高出2个稀释度或更多时，该份被检血清判为阳性，仅高出一个稀释度判为可疑。测定排与对照排阳性反应孔稀释度相同者判为阴性。424注意事项4241诊断液用时要充分摇匀。4242如到最高稀释度测定排与对照排都是阳性反应时，则应再连续稀释下去。一直稀释到第12孔为止。4243血纸勿被蝇等昆虫爬舔，未干时也不能重叠。4244移液
11、器在稀释时吸吹次数要一致，测定排与对照排应分别各用一个移液器头子。43酶联免疫吸附试验(ELISA)431材料准备4311 器材：聚苯乙烯酶标板、酶标仪、5止200 pL的可调移液器(或25 pL、50止、100 pL、200 pL移液器)。4312试剂：锥虫可溶性抗原、辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体、牛血清白蛋白、参考阴性血清、阳性血清、pH96的005 molL碳酸盐缓冲液、pH74的PBS-吐温缓冲液、pH50的柠檬酸盐缓冲液(以上3种缓冲液配方参见附录c)、邻苯二胺、30H：02、2 molL Hzsq。432分析步骤4321 用pH96的005 molL磷酸盐缓冲液将锥虫抗原液
12、稀释到10-gmL，向酶标板各孔内加入200 pL，置于210冰箱中20 h24 h。4322倒去抗原液，用PBS-吐温缓冲液洗涤3次，每次5 min，甩于。用PBS-吐温缓冲液溶解牛血清白蛋白至1 9120 mL，向各孔中加人250 pL，置37湿盒内1 h。4323倒去白蛋白液，同上方法洗涤，甩千。将阴性、阳性血清和被检血清均用PBS液作l：200稀释，各孔中分别加入200 pL，每份血清同样加入2个孔。另设空白对照孔2个，只加PBS液。置373GBT 23239-2009湿盒中l h。4324倒去血清，同上方法洗涤，甩干。将酶标记抗牛IgG抗体按工作浓度稀释后，向各孔中分别加入200,a
13、L，置37湿盒中1 h。4325倒去酶标记物溶液，同上方法洗涤，甩干。加入各孔200 pL底物溶液(参见附录c)，置37湿盒30 rain。4326向各孔中加入50 pL 2molLH。SO,，以终止其反应。433结果判定用酶标仪测各孔中液体光吸收值，计算同一血清2孔平均值，被检血清各孔值大于等于阴性参考平均值2倍者为阳性血清，低于阴性参考血清2倍者为阴性。但如2孔光吸收值中有1孔低于参考阴性血清值的2倍，1孔等于或高于2倍者为可疑，需重做。5综合判定伊氏锥虫病的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊应依靠实验室检查。病原的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。血
14、清学方法主要用于检测伊氏锥虫抗体，在群体水平上进行血清学诊断较易操作、特异性强、敏感性高，但是对个体检测比较困难，有时出现非特异性反应。当在临床上怀疑有伊氏锥虫感染时，可根据实际情况，由上述几种方法中选用一种或两种方法进行确诊。附录A(资料性附录)姬氏染色液的配制与染色方法GBT 23239-2009A1 姬氏染色液的配制姬氏染色粉05 g；甲醇25 mL；甘油25mL。将姬氏染色粉置于研钵中，先加少量甘油充分研磨，再加甘油继续研磨，直至用完25 mL甘油，装入棕色瓶中，用25 mL甲醇分次洗涤剩余甘油，全部注入棕色瓶中，塞紧瓶塞，充分摇匀。置65温箱内24 h或在室温中一周以后过滤待用。A2
15、染色方法用中性蒸馏水或生理盐水按1：1稀释染液，用滴管将稀释染液滴于血膜上，染色20 min30 min。再用蒸馏水冲洗，晾干镜检。GBT 23239-2009附录B(资料性附录)间接血凝试验用的血清稀释液磷酸缓冲液(PBS)B1 0067 molL磷酸氢二钠液：用Na：HPO。12HzO 2377 g，加入重蒸水溶解，再加到1 000 mL。B2 0067 molL磷酸二氢钾液：用KH。Pq 908 g，加入重蒸水溶解，然后加到1 000 mL。B3取0067 molL磷酸氢二钠液72份，加0067 molL磷酸二氢钾液28份，再加入085氯化钠即成PBS。为长期保存可分装后高压灭菌。附录C
16、(资料性附录)酶联免疫吸附试验所需试剂溶液C1 pH96 005 molL碳酸盐缓冲液Na2C03 159 g(或Na2C0310H20 429 g)；NaHC03 293 g；蒸馏水加至1 000mL。c2 pH74 PBS-吐温缓冲液NaCl 8 g：KCl 02 g；吐温一20 05 mL；Na2HP04 29 g；蒸馏水加至1 000mL。c3 pH50柠檬酸盐缓冲液01 moIL柠檬酸液243 mL；02 molL磷酸氢二钠液257 mL；蒸馏水加至100 mL。以上各种溶液均可在010中保存10个月。C4底物溶液邻苯二胺iomg；pH50柠檬酸盐缓冲液25 mL溶解后再加50”L 30H：O：。需在临用前05 h配制。GBT 23239-2009
