1、ICS 13.300;11.100 A 80 喧嚣中华人民共和国国家标准GB/T 27821-20门化学晶细菌DNA损伤或修复试验方法Chemicals-Bacterial DNA damage or repair test 2011-12-30发布2012-08-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 27821-2011 前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准与美国环境保护局(UnitedStates Environmental Protection Agency, USEPA)预防、农药及有毒物质办公室(theO
2、ffice of Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS)的OPPTS870.5500:1998细菌DNA(脱氧核糖核酸)损伤或修复试验(Healtheffect test guidelines-Bacterial DNA damage or repair tests) (英文版)技术性内容一致。本标准做了下列结构和编辑性修改:一一一介绍部分改为引言;一一-增加了范围一章(见第1章)。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准起草单位z中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本标准主要起草人
3、:刘清君、李朝林、林铮、史晓楠、吴维皑。I GB/T 27821-2011 引本标准参考了USEPAOPPTS 870. 5500:1998细菌DNA(脱氧核糖核酸)损伤或修复试验(英文版)。该指南是美国环境保护局(UnitedStates Environmental Protection Agency, USEPA)预防、农药及有毒物质办公室(theOffice of Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS)制定，用来评价农药和其他有毒物质安全性的系列测试指南之一。是OPPTS整合了三个相关部门的测试指南和要求而最终形成，这三个相
4、关部门的测试指导分别是依据美国联邦法规(Codeof Federal Regulations , Title 40) ，第一章的R部分的污染预防和有毒物质办公室(theOffice of Pollution Prevention and Toxics, OPPT)制定的测试指南和要求，美国国家情报社出版的(theNational Technical Information Service, NTIS)农药规划办公室(theOffice of Pesticide Programs, OPP)的测试指南和要求，以及世界经济合作与发展组织(theOrganization for Economic C
5、ooperation and Development，OECD)出版的测试指南。依据有毒物质控制法规(theToxic Substances Control Act , 15U. S. C. 2601)和联邦杀虫剂、杀真菌剂和杀啃齿类动物剂法规(theFederal Insecticide, Fungicide and Rodenticide Act (7 U. S. C. 136 , et seq. )，为满足对测试数据的要求，USEPA把多套指南整合而形成一套最终的OPPTS测试指南，以降低不同测试程序引起的差异。E GB/T 27821-2011 化学品细菌DNA损伤或修复试验方法1 范
6、围本标准规定了化学品细菌DNA损伤或修复试验的试验原理、试验方法、试验步骤和试验数据及报告。本标准适用于化学品细菌DNA损伤或修复试验。2 试验原理细菌DNA损伤或修复试验可用来测试DNA损伤，在一套修复功能健全的菌株和修复功能缺陷菌株试验中，修复缺陷菌株的细胞死亡和生长抑制表现不同。该试验本身并不是用来测量突变事件，而是通过检测受试物与遗传物质的相互作用检测其遗传毒性。通过检测修复功能健全的菌株和修复功能缺陷菌株表现出的不同的生长抑制作用，测试化学品对修复功能健全的野生型菌株和修复功能缺陷的突变型菌株不同的致细胞死亡作用。修复功能缺陆的突变型菌株通常是一种或多种调控DNA损伤修复酶缺陷的菌株
7、。本测试方法可用来检测化学品是否能够与细胞DNA反应导致细胞生长抑制或致死亡作用。化学品与DNA的相互作用可以通过特异的细胞修复系统识别。本方法选择特异DNA修复基因完好和缺陷的一对菌株，由于DNA修复缺陷菌株不能修复某一化学品引起的DNA损伤，其表现为细胞趋向于生长抑制或趋向于死亡。本方法的参考物质包括但不限于氯霉素(chloramphenicol)和甲基磺酸甲醋(methylmethanesul fonate)。3 试验方法3. 1 方法的选择可选用不同的方法进行测试，本方法宜选用以下两种方法:a) 在固相基质上进行的测试(扩散试验hb) 在液相基质上进行的测试(悬浮试验)。3.2 菌株选
8、择3.2. 1 常用菌株宜选择大肠杆菌(EscherichiacoliolA， W31l0/p3478)和枯草杆菌(Bacillussubtilis rec , H17/ M45)。也可选择其他菌株。3.2.2 菌株的准备和保存菌株保存液的准备和保存、生长条件、菌株的鉴定以及所需表型的验证等都应采用良好的微生物试验方法，而且都应记录在案。1 GB/T 27821-2011 3.3 菌株的培养应选用良好的微生物方法，使用新鲜的细菌培养物培养细菌。记录细胞所处的生长期和细胞密度，满足实验设计的要求。3.4 代谢活化应设置加与不加代谢活化系统的平行对照组。常用的代谢活化系统是经酶诱导剂(物)处理过的
9、啃齿类动物的肝匀浆微粒体酶系。也可选用其他种属、组织或方法。3.5 对照组3.5. 1 平行对照每一次试验都应设置阳性对照、阴性对照和溶剂对照。3.5.2 阴性对照阴性对照应不表现出明显的生长抑制作用(即对两种菌株的影响是相同的)。常选氯霉素。3.5.3 基因型特异对照可选用甲基磺酸甲醋作为大肠杆菌试验的基因型特异阳性对照，选用丝裂霉素作为枯草杆菌试验的基因型特异阳性对照。3.5.4 阳性对照用来保证代谢活化系统的有效性试验的阳性对照参考物质，包括代谢活化系统应根据试验选用的活化系统类型确定。3.5.5 其他阳性对照可选择其他阳性对照参考物质。3.6 受试物3.6. 1 溶剂受试物、阳性对照和
10、阴性对照都应潜解在恰当的溶剂中，试验前用溶剂稀释备用。3.6.2 染毒浓度最初试验应选择较宽的染毒浓度范围，染毒的上限浓度的选择应根据细胞毒性的结果和受试物的溶解性来确定。受试物的细胞毒性结果受代谢活化系统的影响。对于溶解性高的元毒化学品，应根据具体情况逐步确定最高剂量。因为扩散试验的结果以获得的生长抑制作用带的直径或范围表示，所以培养皿或培养板中加入的受试物的量应完全一致。如有阳性反应，应用更窄浓度范围进行重复确认。4 试验步骤4. 1 扩散试验4. 1. 1 培养皿扩散试验培养皿扩散试验可采用两种方法=2 GB/T 27821-2011 a) 琼脂中加入单一菌株进行铺板或把菌株涂在琼脂表面
11、，受试物加在琼脂表面的滤纸上;b) DNA修复功能健全的菌株和修复功能缺陷菌株划在同一琼脂表面，把含有受试物的培养皿置于琼脂表面，与细菌接触。4.1.2 培养极扩散试验在培养板扩散试验中，既可把细菌加在琼脂中铺板也可把细菌涂在琼脂表面，把受试物溶液加在含琼脂的培养板中。4.2 悬浮试验4.2.1 用受试物对细菌悬液进行染毒，根据细菌存活量克隆形成数)判断受试物的作用是依赖于时间还是依赖于浓度。4.2.2 对于澄清的细菌悬液，可用一系列的受试物稀释液染毒，得出每一菌株最低的抑制浓度，并可通过观察培养后是否出现可见的生长现象来验证。4.2.3 可使用单一剂量的受试物处理成对的细菌悬液(通常最初是浑
12、浊的)，通过比较浑浊度增加速率的改变判断不同的抑制作用，得出阳性结果。4.3 培养的数量如选用培养皿扩散试验，每一稀释度至少应在两个单独的培养皿进行试验。对于液体悬浮试验，至少应使用两个独立的样本确定存活细胞的数量。4.4 培养条件试验的所有培养皿都应采用相同的培养条件，通常为37oC ,18 h24 h。5 试验数据和报告5. 1 结果处理5. 1. 1 扩散试验应以生长抑制带的直径(以mm计)或生长抑制带的范围(以mm2计)表示结果，如果有剂量-反应数据，应使用相同的单位。5. 1.2 液体悬浮试验5. 1.2. 1 以剂量-反应形式给出菌株的存活数据，宜给出每一菌株存活百分数或存活比例，
13、或者给出两种菌株的相对存活比例。5. 1. 2. 2 结果也可表示为一定存活率的浓度(如D31表示37%存活的浓度)。该数据来源于存活曲线。浓度应以单位体积的量表示，即摩尔浓度。5. 1.2.3 结果还可表示为最小抑制浓度或最小致死浓度。根据液体培养基中是否出现可见的生长得出最小抑制浓度;根据半固体培养基上的受试物稀释浓度得出最小致死浓度。5. 1. 3 原始数据所有的试验中，浓度应以试验处理时的最终浓度表示，并提供原始数据，包括实际测试数，如净值。对于扩散试验，应说明培养皿或培养板的直径，测量结果应说明是否减去了培养皿或培养板的直径。此外，还应说明受试物是否出现快速、弥散及双向的生长抑制带。
14、如果出现了双向生长抑制带，应说明对3 GB/T 27821-2011 内带和外带是否都进行了测量。5. 1. 4 活性计数以某一稀释度下培养皿真正的计数和涂板的体积或原始滴度(细胞数每毫升表示。不应仅提供最终的结果(如比率、差异、存活比)，而不提供原始试验数据。5.2 统计评价应选用恰当的统计方法进行评价。5.3 结果的判断5.3. 1 阳性结果的判断有多个标准。其一为修复缺陷菌株出现具有统计学意义的剂量相关的抑制趋势或死亡差异。另一标准为至少在一个测试点，出现可重复的、具有统计学意义的阳性反应。5.3.2 如果某一受试物在修复缺陷菌株上未见具有统计学意义的剂量相关的抑制趋势或死亡差异，在所有
15、的测试点，也没表现出可重复的、具有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物与所用试验系统中的遗传物质没有相互作用。5.3.3 在评价时应同时考虑生物学上的显著性和统计学上的显著性。5.4 测试评价细菌的DNA损伤或修复试验既不是用来测量DNA损伤本身，也不是用来测量突变。该试验是检测DNA损伤表现出的细胞死亡或生长抑制。如果在某一试验系统中，受试物的DNA损伤试验的结果为阳性，但在另一个试验系统中为阴性，如果没有更好的试验数据，其结果很难判断。5.5 测试报告4 试验报告应包含以下信息:一一所用细菌的种属;一一试验菌株的生长期;一一培养基的组分z一一所用制备代谢活化系统和试验所用其他方法的详细资
16、料;一一处理方法，包括使用剂量和剂量选择的原理、阳性对照和阴性对照的选择原理;一一细胞死亡程度的判定方法;一一剂量-反应关系(如果能够提供)。GB/T 27821-2011 参考文献lJ Ames, B. N. et al. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/ mammalian-microsome mutagenicity test. Mutation Research. 1975 ,31: 347-364 2J Kada, T. et al. In vitro and host-mediat
17、ed rec-assay procedures for screening chemical muta gens; and phloxi肘，amutagenic red dye detected. Mutation Research.1972 ,16 :1 65-174 3J Leifer,Z. et al. An evaluation of bacterial DNA repair tests for predicting genotoxicity and carcinogenicity:A report of the U. S. EPA s Gene-Tox Program. Mutati
18、on Research. 1981 ,87: 211-297 4J Slater, E. E. et al. Rapid detection of mutagens and carcinogens. Cancer Research. 1971 ,31: 970-973 5 -FON-ghNH阁。华人民共和国家标准细菌DNA损伤或修复试验方法GB/T 27821-2011 国中化学晶* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷f印刷各地新华书店经销晤印张O.75 字数11千字2012年4月第一次印刷开本880X12301/16 2012年4月第一版晤16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价书号:155066. 1-44569 GB/T 27821-2011 打印日期:2012年4月26HF002A
