1、ICS 13.300;1 1. 100 A 80 中华人民11: ./、GB 和国国家标准GB/T 27826-2011 化学品神经发育毒性试验方法Chemicals-Test method of developmental neurotoxicity 2011-12-30发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会2012-08-01实施发布GB/T 27826-2011 目lJ1=1 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南No.426(2007年)(神经发育毒性试验)(英文版技术性内容一致。本标
2、准做了下列结构和编辑性修改:一一-增加了范围一章;一一计量单位改成我国法定计量单位5一一将OECD426原文中的介绍和初步考虑部分作为本标准引言。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、上海出入境检验检疫局、中国化工经济技术发展中心。本标准主要起草人:刘清君、林铮、李小林、邱璐、杨挺。I GB/T 27826-2011 百|1995年6月，OECD生殖和发育毒性工作组在哥本哈根召开会议，讨论对现有的OECD生殖和发育毒性的试验指南进行更新，但未包括对原有试验终点进行改进IJ。工作组建议，神经发育毒性的
3、试验指南应以美国环保署试验指南为基础2J0 1996年6月，工作组在哥本哈根召开第二次协商会议，大会提交了新神经发育毒性试验指南纲要，其中包括动物种属选择细则，染毒周期、试验周期、试验终点和结果评价标准等试验要点的详细资料。1998年美国出版了神经发育毒性危险性评价指南3J，2000年10月，OECD专家咨询会和ILSI风险科学研究工作组相继召开会议，并于2005年在东京召开专家协商会议4-7J。这些会议讨论了当前试验指南所涉及的科学和技术问题。本标准参考了OECD化学品测试指南No.426(2007年)(神经发育毒性试验)(英文版)。试验指南中关于操作、解释和试验中所用术语的资料参考了试验指
4、导文件No.43生殖毒性试验和评估田和No.20神经毒性试验问。许多化学品都能够引起人类和其他动物出现神经发育毒性10叫。单一化学品或混合物(通称受试物)潜在的神经发育毒性测试可用于受试物的毒性特征评价。神经发育毒性研究能够反映子代在子宫内和生命早期由于暴露因素而引起的神经系统的形态改变和功能异常，并提供剂量-反应关系资料。神经发育毒性试验可单独进行，也可合并生殖毒性和/或成年动物的神经毒性研究，或出生前发育毒性研究141710如神经发育毒性合并到其他试验中，必须确保两项试验的完整性。所有试验都应遵守当地政府和研究机构的实验动物使用准则叫。试验开始前，应考虑分析受试物所有的资料，包括受试物的名
5、称、化学结构、理化特性和其他体内或体外毒性试验结果;结构相关化合物的毒理学资料以及受试物的预期使用等。这些资料既有助于试验时对人类健康保护提供必要的信息，也有助于选择合适的试验初始剂量。E G/T 27826-20门化学晶神经发育毒性试验方法1 范围本标准规定了化学品啃齿类动物神经发育毒性试验的缩略语、试验原则、试验准备、试验程序、试验数据和报告。本标准适用于检测化学品的神经发育毒性。2 缩略语下列缩略语适用于本文件。NOAEL:未观察到有害作用的剂量(no-observed-adverseeEffect) GD:娃振当天(gestationday) PND:分娩当天(postnatalday
6、) DMPT:延迟匹配状态(delayed-ma tching-to-posi tion) CNS:中枢神经系统(centralnervous system) PNS:周围神经系统(peripheralnervous system) GFAP:胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein) 3 试验原则3. 1 对娃振期和哺乳期的动物进行染毒，不仅能评价受试物对娃振期和哺乳期母体的影响，还能比较亲代和子代动物所出现毒作用的不同。进行神经毒性评价的子代动物应经随机选择。神经毒性评价主要包括总体的神经行为异常评价以及出生后及成年脑重和神经病理评价，神经行为异常评价
7、包括身体发育、个体行为、运动活力、运动和感觉功能以及学习和记忆等。3.2 如果神经发育毒性试验独立进行，除基本的项目外，动物量还应满足特定的神经行为、神经病理及电生理检查需要，这些检查项目是对标准中基本检查项目的重要补充16.19-21J。当评价某些依赖经验观察的、预期的、机制/作用模式表明的某一特殊类型的神经毒性时，这些检查项目尤其有用。这些检查项目获得的资料可能对评价亲代和子代动物的毒性都有用。此外，如不改变体内实验的完整性，还可进行离体试验或体外试验。4 试验准备4. 1 动物种属的选择试验首选大鼠，也可选用其他合适的动物。但本标准中的娃振期和哺乳期天数均是指一般大鼠才日使用其他种属动物
8、或特殊品系的大鼠，应当选用相对应的天数。如果选择其他种属的动物，应根据相应的毒理学、药代动力学和/或其他资料说明其合理性，包括所用动物出生后神经行为发育种属特异和神经病理评价可行性。如果以往引起关注的试验，仍应考虑使用引起关注的种属和品系的动物。由于不同品系大鼠的特性不同，应确保所用动物品系有足够的繁殖能力和敏感性。选用其他种属动物检测神经发育毒性的可靠性和敏感度应具有相应的文献依据。GB/T 27826-20门4.2 动物饲养环境和条件4.2. 1 动物房温度应在22.C土3.C。相对湿度应大于30%，最好不超过70%，除了在打扫卫生外，湿度应保持在50%60%。采用人工昼夜，12h明暗交替
9、。为了在黑暗期间评价(红光下)功能学和行为学的研究终点，即动物的活动是否正常，也可在交配前和试验期间改变光照循环22J。改变光照后，应该给动物足够的时间适应新的光照循环。常规喂饲，自由饮水。报告中应列出动物饲料和饮水的类型，分析饮水和饲料中的污染物。4.2.2 动物单笼饲养或按性别群笼饲养。交配操作应在适宜的笼中进行。动物交配成功后且娃振第15天前，娃振动物应转移到繁殖笼内。笼具的放置时应尽可能减少放置引起的影响。娃振动物临近分娩时需提供合适的垫料。为防止非处理因素引起的流产，对娃振期动物的处理应十分小心，尽可能避免外界因素干扰引起的不良情绪，如噪声的干扰。4.3 动物准备试验所用的动物应是健
10、康的、已经适应实验室环境的，并且之前没进行过试验的(本项试验是合并其他试验除外)。应明确受试动物的种属、品系、来源、性别、体重和年龄。对动物进行分组，编号。所有动物的体重，年龄均在试验要求动物品系的范围内，并尽可能一致。每个剂量水平都应使用健康成年且未生育的雌性动物。试验中应避免发生近亲交配(同窝)。阴道内观察到阴栓和/或精子的时间为娃振第0天CGD0)。购买的娃振动物应保证其有足够的适应时间(2d3 d)。交配的雌性动物随机分配到试验组和对照组，保证各组分配均匀(推荐根据动物体重采用分层随机程序分组)。由同一雄性动物受精的雌性动物应均衡的分配到各试验组中。5 试验程序5. 1 动物的数量和性
11、别5. 1. 1 每个试验组和对照组应有足够数量的娃振动物供染毒，确保有足够的子代动物进行神经毒性评价，建议每个剂量20窝动物。如每个剂量组都获得了足够数量的窝数，可考虑重复参差剂量Creplicateand staggered-group dosing)设计，对于重复样品应选用恰当的统计模式进行分析。5. 1. 2 出生后4d之内分娩当日为PND0)，按照随机的原则剔除每窝多余的子代，使每窝子代数尽可能一致叫。每窝子代的多少不能超过所用品系动物的正常平均值8-12J。每窝子代雄性和雌性数尽可能相等。不能选择性的剔除子代，如按照体重的大小来剔除胎仔是不合适的。选择完后进行下一步试验前，应确定哪
12、些用于断乳前的试验，哪些用于断乳后的试验，并对每只子代动物进行标记阳。5.2 用于功能和行为测试，脑重测量和神经病理评价的动物分配5.2. 1 对于宫内及整个哺乳期染毒的动物，允许采用多种方法进行功能和行为测试，性发育、脑重和神经病理评价叫。只要不影响整个试验的完整性，根据具体情况可以加入其他神经行为功能(如群居行为)，神经化学及神经病理检查。5.2.2 在分娩第4天或第4天之后，对每个剂量组选择的子代动物进行毒作用终点评价。每一个评价项目应尽可能从每窝选择两种性别的动物，各个剂量组动物构成应尽可能一致，并且能够代表各自的性别。运动活性试验应在断乳前选择同一对雄性和雌性子代进行检查。其他试验中
13、可采用相同或不同对的雌雄子代进行行为学试验。对于认知功能试验的子代应该分为断乳期和成年期，避免年龄和前期锻炼等混杂因素对结果的影响26-27J。在断乳期CPND21)，不需要的子代可以实行安乐死。对子代动物处置的任何变更都应写入试验报告。对测量值的统计是以窝(动物)或每只亲代为单位，而不是以子代为单位。2 GB/T 27826-2011 子代动物断乳前和断乳后检查包括多个试验，有认知测试，病理检查等(见图l综合动物分配设计和附录A的分配举例)。断乳前和断乳后试验项目所需每个剂量组动物最少数量如表l所示。|每组刷刷物|子代动物=各剂量组不同性别各约80只选择出生后4d或不足4d的动物进行断奶前及
14、断奶后的检查zI临床观察和动物体重(所有动物)详细的临床观察(每组不同性别各20只)个体行为发育(每组不同性别各20只)运动活性(每组不同性别各20只)性成熟(每组不同性别各20只)运动和感觉功能(每组不同性别各10只-20只)神经病理:PND 11-22 每组不同性别各10只2脑组织浸泡或灌注固定进行神经病理检查:脑重(固定)。可选项z其他试验每组不同性别各20只z脑重(不固定)神经病理:PND 70(试验结束时)每组不同性别各10只z大脑灌注固定，用于神经病理评价g每组不同性别各10只z脑重(不固定)剩余其他不语进行神经病理检查动物。每组不同性别各40只-50只可选项g其他试验注:此图主要
15、基于4.2的描述资料，试验动物的分配举例参见附录A。图1子代动物功能/行为测试、神经病理检查以及脑重的试验实验流程表1断乳前和断乳后试验项目所需每个剂量组动物最少数量一般临床观察和体重所有动物详细的临床观察20只/性别1只/C性别窝)J脑重(固定后)PND11-22 10只/性别(1只/窝)脑重(禾固定)-PND 70 10只/性别(1只/窝神经病理学(浸泡或灌注固定)PND11-22 10只/性别(1只/窝)神经病理(灌注固定)-PND70 10只/性别(1只/窝)性成熟20只/性别(1只/窝)其他发育指标(可选)所有动物个体行为发育20只/性别口只/C性别窝)J运动活力20只/性别口只/C
16、性别窝)J运动和感受功能20只/性别口只/C性别窝)J学习和记忆10只/性别(1只/窝a根据认知功能测试的敏感度的高低，需要考虑试验可能会需要较多的动物数，例如，最多可考虑每窝动物雌雄各一只(动物的分配见附录A)，动物样本安排的详细指南可见OECD指导性文件NO.438J。3 GB/T 27826-2011 5.3 剂量5.3. 1 试验至少设三个剂量组和一个平行对照组，各剂量水平应有合适的间隔。如果不受受试物的理化特性或生物学特点的限制，选择的最高剂量应能够诱导出一定的母体毒性，如临床症状，体重增长降低(不得超过10%)和/或靶器官出现剂量-限定毒性Cdose-limiting toxici
17、ty)。特殊情况外(如预期人群暴露剂量可能更高)，最高剂量为1000 mg/ Ckg. d)。此外，还可以通过预试验或剂量确定试验来寻找能够引起母体出现最小毒性的最高剂量。如果在标准的发育毒性试验或预试验发现受试物有发育毒性，最高剂量水平应不能引起子代出现严重的毒性、死胎、围产期死亡或胚胎畸形，确保受试物的发育神经毒性试验能够得到有意义的结果。最低剂量应不引起任何的母体毒性和发育毒性(包括神经毒性)。选择的从高到低的剂量水平应能够说明剂量反应关系和NOAEL，或者该剂量接近检测的限值，用以确定基准剂量。设定最佳递减剂量水平的组间距通常为2倍4倍u如果试验增设了第四个剂量组，选择的组间距通常较大
18、10倍。5.3.2 剂量水平的选择应考虑受试物及其结构相关物质已有的毒性数据以及代谢和毒代动力学资料。这些资料还有助于证实染毒方案是否合理。根据染毒情况和药代动学资料，可以考虑对子代直接染毒28-29J。在对子代直接染毒之前应充分考虑其优缺点:叫。5.3.3 对照应当是未处理组或赋形剂对照组(如配制受试物使用了赋形剂)。根据体重，所有动物都给予相同体积的受试物和赋形剂。如果染毒配制受试物使用了赋形剂或其他的添加剂应考虑:其对受试物的吸收、分布、代谢或贮留的影响;对受试物的化学特性的影响(可能改变受试物的毒作用特征);对饲料和饮水的摄入量以及动物营养状况的影响。赋形剂不能干扰试验结果的解释，例如
19、既不能有神经行为毒性也不能对动物的生殖和发育产生影响。对于新的赋形剂，除了一般对照组外还应设置赋形剂对照组。对照组动物的处理应当与实验组完全相同。5.4 染毒5.4. 1 依据己有试验的代谢和分布资料，受试物和赋形剂的染毒方式应尽可能与潜在的人类暴露途径一致。常用的染毒方式是经口染毒(如灌胃、掺入饲料、饮水)，根据受试物的特点以及预期或已知的人类暴露途径，也可选用其他染毒途径(如经皮、吸入。应当提供染毒途径选择合理性的依据。每天尽可能在相同的时间染毒。5.4.2 尽可能根据每只动物近期的体重确定染毒量(体积但是在娃振期的后1/3，调整染毒量应谨慎。如果处理组娃振动物出现过重的毒性，对这些动物应
20、实行安乐死。5.4.3 受试物和赋形剂染毒时间至少应该从胚胎植入(GD6)期持续到哺乳期CPND21)结束。如有证据表明适当调整染毒开始时动物的年龄，染毒持续时间和染毒频率与人类暴露的情况更加相关，则可以对染毒方案进行调整。如使用其他种属动物，为确保受试物的暴露在大脑整个发育早期(相当于出生前和出生后早期人类大脑的生长发育)，应对染毒时间做适当调整。虽然应考虑受试物暴露可能引起着床前丢失，但染毒可以从娃振当日CGD0)开始。娃振6dCGD 6)开始染毒虽然可以避免着床前丢失，但娃振od6 dCGD 0-6)发育阶段未能暴露受试物。对于购买的娃振动物，不可能在娃振当天CGD0)开始染毒，因而应当
21、在娃振第6天CGD6)开始染毒。根据受试物的毒作用相关资料、预试验、逻辑关系制定染毒方案，包括动物断乳后如何继续染毒。动物分娩当天不染毒。通常情况下，都假定子代能够通过母乳继续暴露受试物;然而，如果没有子代继续暴露的证据，可以考虑直接对子代进行染毒。可以通过药代学信息，子代毒性或生物标志物的变化等获得子代是否暴露的证据削。4 GB/T 27826-2011 5.5 亲代动物的观察5.5.1 所有亲代动物至少每天观察一次，观察其健康状况，包括发病和死亡。5.5.2 除了上面的观察外，在染毒期和观察期，应定期进行详细的临床观察(在娃振染毒期和哺乳染毒期至少分别观察两次)，每个剂量水平至少需观察10
22、只娃振动物(子代)。由不参与该试验的熟练技术人员从笼取出动物进行观察，按照标准操作规程减少对动物应激负荷和观察者的偏倚，并可能增加观察的可信度。如果可能，建议整个试验过程中由同一观察人员进行观察。5.5.3 记录出现的所有症状。记录时尽可能对所观察到症状进行量化。临床观察包括(但不限于)皮肤、毛发、眼睛、蒙古膜、分泌物以及自主活动(如流泪、竖毛、睡孔大小、不正常的呼吸方式和/或张口呼吸、异常的排尿或排便)的变化。5.5.4 记录任何与体位、活动水平(如标准活动区域的减少或增加)等有关的不正常的反应和运动协调能力的改变。记录步态(如步态不稳、共济失调)，姿势(如拖尾)，对操作、位置或其他环境剌激
23、的反应性，以及阵孪性，抽擂，震颤，刻板动作(如过度理毛行为、异常的头部运动、转圈)，奇怪的行为(如撕咬或过度的舔献、自残、倒退、异常叫声)，以及攻击行为等。记录毒性症状，包括症状开始的时间、天数、程度以及持续时间。5.5.5 整个实验过程中动物至少每周称重一次;临近分娩或分娩当日，出生第21dC断乳)时应称重。灌胃染毒时，娃振动物每周称重两次，根据动物体重对染毒量做适当调整。至少应在娃振期和哺乳期每周测量一次摄食量。如通过饮水染毒，至少每周测量一次饮水量。5.6 子代动物的观察5.6. 1 所有子代动物至少每天观察一次，观察出现的毒性症状、发病和死亡。5.6.2 在染毒期和观察期，应对子代进行
24、详细的临床观察。由不参与该试验的熟练的技术人员对子代进行观察，至少观察l只/C性别窝)，按照标准化操作规程进行操作。如果可能，建议整个试验过程中由同一观察人员进行观察。5.6.3 记录子代动物所有的毒性症状，包括症状开始的时间、天数、程度以及持续时间。5. 7 子代动物身体发青指标的观察5.7.1 断乳前的发育指标(如四股伸开、睁眼、切牙萌出)的变化与体重呈高度相关性。体重可能是身体发育的最好指标。因此，只有在已有证据表明这些发育指标能提供额外信息时，才推荐测量这些指标。这些参数的评价时间见表2。根据预期的毒作用和早期测试的结果，可以增加额外的时间点或在其他发育阶段也进行评价阳。表2生长发育指
25、标(功能性/行为学终点评价时间表年龄终点断乳前b青春期b成年b身体发育指标体重和临床观察每周1次c至少每2周1次至少每2周1次脑重PND 22d 试验结束神经病理PND 22d 试验结束5 G/T 27826-20门表2C续)年龄终，点断乳前b青春期b成年b性成熟适当时间其他发育指标e适当时间功能/行为终点个体行为发育至少2项引动反射(包括适应)1次-3次f1次运动和感受功能1次1次学习和记亿1次1次a本表中给出了评价所需的最小评价次数。根据预期的毒作用和早期测试的结果，可以增加额外的时间点(如成年后)或在其他发育阶段也进行评价。b建议子代在断乳2d内不进行试验。对于青春期评价项目的时间为:学
26、习记忆=PND25土2，运动和感觉功能=PND25土2。对于成年早期评价项目的时间为PND60-700 c对于子代直接染毒，当动物进入体重快速增长期时，至少应每周称重2次，并根据体重调整染毒剂量。d脑重和神经病理评价可以在早些时候(如PND11)进行。e体重外的其他发育指标(如睁眼)应当记录。f见5.9。5.7.2 最好在性发育成熟阶段而不是出生后评价身体发育问。为避免断乳应激引起的混杂效应对结果影响，对于子代应在预期的断乳当天进行的试验，建议改在实际断乳之前进行。另外，断乳后子代的试验应在断乳2d后进行。5.7.3 计数存活子代，通过肉眼检查或测量虹门与生殖器之间的距来确定动物的性别34叫。
27、每只子代应在出生后尽早称量体重，在哺乳期每周至少称量一次体重。每窝至少分别选择雌雄各一只检查阴道开口特征川、包皮分离程度用来评价性发育程度;37，同时记录年龄和体重。5.8 个体行为发青在适当的年龄阶段，选择1只/C性别窝)进行个体行为发育评价，在整个试验过程不同时间使用同一动物检查所有的行为发育项目。进行检查时间间隔应均匀，评价时应能够区别个体行为发育变化是正常的还是由暴露因素引起的呵。以下三项是用于评价行为个体发育:翻正反射，负趋地性和运动活力38-40J。5.9 运动活力运动活力的检测应当在断乳前和成年后进行41-45J。对于断乳期的试验参考子代身体发育指标的检查。试验时间应足够长，确保
28、非处理对照组有足够的时间适应。建议应用运动活力来评价个体行为发育。如运动活力作为个体行为发育测试指标，则断乳前的所有试验应使用同一动物。测试频率应保证能够评价适应的个体行为发生过程叫，这要求在断乳前(包括断乳当天)至少评价三次(如出生后13 d、17d和21d)。使用同一动物或同窝动物在成年期接近试验终止时还需进行评价(女日出生后第60天70天)，也可在增加其他时间点进行评价。运动活力应由自动活动记录仪进行监测，该仪器能够检测到活动的增加或减少，由仪器所测定出来的运动活力基线不能太低，以便能够检测到运动活力降6 GB/T 27826-20门低;也不能太高，以便能够检测出运动活力的增加。每个仪器
29、应按照标准程序进行校验测试。试验组应尽可能使用不同的仪器进行测试，每只动物应单独进行。试验组在不同测试时间的测试应尽量交叉平衡，避免生理活动节律引起的混杂因素。努力减少试验条件的变化，降低处理因素有关的系统误差。影响行为测试(包括运动活力)指标的因素包括声音的大小、笼具的大小和形状、温度、相对湿度、照明、气昧、普通家笼还是新型笼具以及其他环境因素等。5. 10 活动和感觉功能至少应当分别在青春期和成年初期如出生后第60天70天(PND60-70)J对活动和感觉功能进行一次详细的检测。在断乳期间进行的测试参考子代身体发育指标的检查。应进行足够的测试，确保有足够的感觉功能(如本体感觉、前庭)和运动
30、功能(如力量、协调)的样本进行定量分析。伸肌延伸反应46、翻正反射41-48、听觉惊吓适应40.49叫和诱发电位55等只需少量的样本即可。5.11 学习和记忆测试学习和记忆功能相关的测试应分别在子代断乳后(如PND25:f:2)和成年后(PND60及以后)进行。断乳后进行的测试子代身体发育指标的检查。在发育这两个阶段可以进行相同的或单独的测试，学习和记忆试验的选择可以有适当的弹性。但是试验的选择应满足两个标准。第一，学习试验可通过评价几次重复交叉学习出现的变化，也可以通过评价与锻炼经验不相关的一次测试来进行。第二，除了最初所获得的学习外，试验应当包括一些短期或长期记忆的测量;但在元法测量从相同
31、的试验得到的获得性记忆时，则不能报告记忆的测定结果。如学习和记忆测试结果表明受试物有作用，则需进行其他的试验，并根据感觉、动机性和/或运动性能力改变作出解释说明。除了上述两个标准外，选择学习和记忆试验类型时应以文献中已经证明了的对同类化合物具有明确灵敏度的方法。如没有相关资料，满足上述标准的试验包括:被动回避试验(passiveavoidance)川6-51、成年大鼠和幼鼠的延迟匹配状态(DMTP)试验58叫、嗅觉条件反射(olfactoryconditioning) 43.60、莫里斯水迷宫试验(Morriswater maze)【61叫、比尔或辛辛那提水迷宫试验(Bielor Cincin
32、nati maze)64-65、旋臂迷宫试验(radialarm maze) 66、T-迷宫(T-maze) 43和获得性或固有性的程序控制行为试验(acquisitionand retention of schedule-controlled behaviour) 26.61叫等。对于断乳大鼠和成年大鼠的其他试验方法可以参考相关文献lm，ZM105. 12 动物安乐死后检查项目5. 12. 1 亲代在子代断乳后可以实施安乐死。5. 12.2 子代动物的组织神经病理学评价可以在出生后22d(PND 22)或在出生后第11天22天之间(PND 11-22)，也可在试验结束时对动物实施安乐死后取材
33、进行。在出生后第22天(PND22)安乐死的子代，应评价脑组织;在试验结束时处死的动物，检查CNS和PNS。在PND22及之前安乐死动物的神经组织可通过浸泡或灌注进行固定。试验结束时安乐死的动物都应进行灌注固定。对组织样品的所有处理，从动物灌注，组织样品的取材分类，组织处理，到切片染色都应均衡处理，使每个剂量组的每一批样品都具有代表性。神经病理检查的指导性文件见No.209.103。5. 13 组织样晶处理应特别注意在大体解剖观察到的所见异常。组织样品应能代表神经系统的各个主要部位，并且按照标准组织学操作方法进行保存和处理臼川。CNS和PNS组织可以采用石蜡包埋;如果需获得较高分辨率的观察结果
34、，建议使用俄酸后固定和环氧树脂包埋技术(通常是在怀疑出现周围神经病和/或周围神经形态改变时采用)。同时收集所有剂量组的脑组织并选用恰当的介质包埋，以便进行形态学检查分析。包埋可以避免由于在固定剂中长期保存引起的组织收缩等因素影响阳。7 GB/T 27826-2011 5. 14 神经病理学检查5. 14. 1 定性检查的目的是:一一确定神经系统内出现神经病理改变的部位和区域;二一一确定暴露受试物引起的神经病理改变的类型;一一确定神经病理改变的严重程度范围。5.14.2 由熟练的病理学家通过显微镜观察代表性的组织切片，寻找神经病理改变的证据。所有的病理改变应按照等级评价表明其严重程度。对出生后第
35、22天CPND22)及此前处死的动物脑组织切片，使用铁苏木素和伊红染色就能够满足评价的要求。对试验结束时处死动物的CNS和PNS切片，推荐采用髓磷脂染色法(如勒克勒斯固兰/甲酣紫染色)和嗜银染色法(如Bielschowskys或Bodians染色)。根据病理学家的专业判断以及观察到的改变的类型，也可采用其他类型的染色法用于鉴定特殊类型的改变如GFAP和植物血凝素组织化学法评价胶质细胞和小肢质细胞的变化问、绿色荧光标记检测坏死、银染法检测神经变性等73-75。5.14.3 形态学(定量)评价获得的资料有助于确定暴露-效应关系，并可以用于解释与暴露相关的脑重或形态学改变的差异7677。神经组织的取
36、材和制备应保证能够进行形态学评价。形态评价包括，特定脑区的线性或区域的测量明。应用可靠的显微标志认真选择同源切片来进行线性或区域性测量并进行分析610可使用立体测量技术鉴别由受试物暴露引起的相关参数的改变，如特定神经解剖区域的体积或细胞数的改变79叫。5.14.4 检查脑部，寻找任何与处理因素有关的神经病理改变的证据，所有主要区域，如嗅球，大脑皮质，海马，基底神经节，下丘脑，中脑(顶盖，被盖、大脑脚)，脑桥，延髓，小脑等都应有足够样本确保能够进行全面检查。动物的切片均应取自同一平面。成年动物在试验结束安乐死后，应对脊髓不同横断面和PNS代表性的结构进行取样，包括眼(包括视神经和视网膜)，脊髓的
37、颈、腰膨大部，背侧和腹侧神经根，近端坐骨神经，近端腔神经(膝部)，以及腔神经在排肠肌的分支。脊髓和周围神经的切片应包括横切面和纵切面。5. 14.5 除了检查细胞学改变(如神经性空泡、变形和坏死)和组织学改变(如神经胶质瘤、白细胞浸润、装状形成)外，神经病理评价还应包括神经系统发育损伤的检查6，85-89。因而，将处理因素引起的相关作用与己知的相应的发育阶段发生的各种正常发育事件区分开来显得非常重要川。发育损伤所涉及的改变有以下情况(但不限于此): 一一嗅球，大脑或小脑的大体的体积和形状的改变;一一各个脑区相对大小的改变，包括由于正常细胞群或神经投射(如小脑的外胚层、脚服体)的出现或丢失引起脑
38、区的增大或缩小;一一增殖，迁移和分化的改变，即出现过度凋亡或坏死的神经元，神经元的聚集在和异常分布，来源不清和分化异常的神经元，大脑皮质各层结构相对大小的改变;一一髓黯形成的改变，包括整个髓辅轮廓的减少或髓黯着色结构的改变;一一出现脑积水，脑室的异常增大，中脑水管的狭窄和大脑半球变薄。5.15 神经病理学改变的剂量反应关系分析推荐使用以下分步程序对神经病理学检查结果进行定性和定量分析。第一，将高剂量组的病理切片与对照组进行比较。如高剂量组没有发现神经病理改变的证据，则不需对其他剂量组进行分析。如高剂量组出现病理改变的证据，则中、低剂量组动物也应进行神经病理检查分析。如高剂量组由于动物死亡或其他
39、混杂因素终止，则高剂量组和中间剂量组都应进行神经病理改变分析。如在低剂量组出现神经病理改变，则所有剂量组都应进行神经病理分析。第二，如在定性和定量检查中发现了与处理因素相关的神经病理改变，则应当根据所有各组动物的评价结果，确定病理改变的发生率、发生频率和严重GB/T 27826-2011 程度以及形态学测量改变的剂量依赖性。评价应当包括出现神经病理学改变的所有区域。对每种损伤类型，需确定不同严重等级的特征，并指出用于区分每一等级的差别。记录每种损伤类型发生的频率和严重程度并进行统计分析，评价剂量-反应关系的性质。推荐使用具有编号的载玻片91J。6 试验数据和报告6. 1 数据以表格的形式报告每
40、一个数据，表明每个试验组变化的类型、雌性亲代数、每种性别子代数、每个类型改变的窝数。如对出生后子代动物直接染毒，应报告染毒途径、持续时间和染毒周期。6.2 结果评价和解释6.2. 1 神经发育毒性试验能够提供在娃振期宫内和出生后发育早期反复暴露受试物而引起的毒作用资料。试验结果应能够区分发生在没有系统母体毒性时的神经发育毒性作用和产生母体毒性的剂量水平时的神经发育毒性作用。由于试验设计，统计分析和资料的生物意义的复杂相互关系，需专家进行判断神经发育毒性的资料的解释是否恰当口07-叫。对试验结果进行解释时需要使用证据权重法(weightof-evidence- approach) 20.92叫。
41、讨论行为学或形态学发现，以及剂量-反应的证据。所有神经发育毒性评价相关的试验数据，包括人类流行病学资料和病例报告，动物试验资料(如毒物代谢资料、结构-活性资料、其他毒性研究资料)都应当用于发育毒性讨论，包括接触受试物的剂量和每种性别动物是否出现神经毒性以及毒性发生率、严重程度之间关系的讨论分析20.95J。6.2.2 对资料的评价包括生物学和统计学意义的讨论。统计学分析应该是对资料解释起指导作用而不是决定作用。缺乏统计学意义并不是做出与处理因素元相关作用的唯一理由，也不能把有统计学意义作为与处理因素有相关作用的唯一理由。由于难以克服证实阴性结果的困难，为避免可能的假阴性结果，特别是如没有发现与
42、处理因素有相关作用时，应结合已有的阳性对照和历史对照资料进行讨论UOLIO610根据对资料总的统计评价，应对假阳性结果出现的概率进行讨论问。评价还应包括观察到的神经病理学改变和行为改变之间的关系。6.2.3 所有的结果应选择适合试验设计的统计模型来进行分析叫。根据资料(原始数据或转换过的数据)的性质和分布特征以及所选择的统计分析的相对效率等因素，选择恰当的参数统计或非参数统计方法。试验的目的和设计决定了需要的统计分析方法，应减少发生I类(假阳性)错误和E类(假阴性)错误96札川叫。使用一胎多产动物(每窝里有多个胎仔)进行发育研究的试验，统计模型应以窝为单位，降低I型错误发生率98-10IJ。测
43、量的统计学单位应当是窝，而不是单只子代动物。试验设计时，每窝中的动物不是独立的观察量。个体在任何毒作用终点重复测量的结果分析应当选用非独立统计模式进行分析。6.3 试验报告试验报告包括以下信息:a) 受试物:一一物理性质和相关的理化特性;一一识别资料，包括来源;一一制备的纯度，已知和/或预测的杂质。b) 赋形剂:一一如不是使用水或生理盐水作赋形剂，应说明选择赋形剂的理由。c) 受试动物:一一种属品系，如不是大鼠，说明其理由;9 GB/T 27826-2011 一一试验动物的供应商;动物的数量，试验开始时的年龄，性别;一一来源，饲养环境，饲料，饮水等;一一一试验开始时的每个动物的体重。d) 试验
44、条件:一一剂量水平选择的理由;一一染毒途径和染毒时间周期选择的理由;一一受试物的制备，包括赋形剂、受试物的体积和物理状态的详细信息;一一受试物制剂的配制/饲料的制备，受试物在制剂或饲料中的浓度，稳定性和均一性等详细资料;一一亲代和子代动物标识编码方法;一一亲代分组，子代选择、分配的随机化操作的详细描述;一一受试物染毒的详细情况;将饲料/饮水或吸人受试物的浓度(mg/L)转换成实际剂量mg/( kg d) 的方法(如有); 一一环境条件;一一一饲料和水(自来水、蒸馆水)质量的详细情况;一一试验开始和结束的时间。e) 观察和试验操作步骤:一一采用标准化观察操作程序和观察结果评分定义的详细描述:一-
45、所有试验程序的名单，以及使用的理由;一一行为/功能，病理，神经化学或电生理等检查操作的详细资料，包括自动化仪器的信息和详锢资料;二一校准和确保测量仪器一致、试验中处理组组间平衡的方法;二一对涉及到专业评价决议的简要说明。f) 结果(单-数据以及汇总资料，包括均数和变异): 10 一一试验开始和结束时动物的数量;一一每项检查所用的动物数和窝数;一一每只动物的编码和其来源;一一按性别列出出生时每窝子代的多少和平均体重;一一体重和体重改变资料，包括亲代和子代动物试验结束时的体重;一一食物摄入量资料，饮水摄入量资料(如果受试物通过饮水染毒); 一一按性别和剂量水平列出动物出现毒性反应的资料，包括毒性症
46、状、死亡率、死亡时间和原因;一一一临床观察症状的性质、严重程度、持续时间、起始时间、持续时间以及发展结局的详细资料;观察时间点的发育指标(如体重、性发育和个体行为发育)的评分;按性别列出动物出现的行为、功能、神经病理、神经化学，电生理检查的详细描述;(包括与对照相比出现增加还是减少); 一一解剖结果;-一脑重;对神经系统症状和损伤所做出的诊断，包括自发产生的疾病或状况;一一样本特殊结果的照片zGB/T 27826-2011 一一-形态检查中评价切片同源性的低倍照片;吸收和代谢资料，包括各个独立的毒物代谢动力学试验获得的补充资料;一一结果的统计处理，包括用于分析资料的统计学模型及统计结果(元论统
47、计结果是否有统计学显著性意义); 一一参加试验人员的名单，包括相关专业经历。g) 结果讨论:一一按性别和剂量水平是否存在剂量-反应关系;按性别和剂量水平分析出现的其他毒性作用与受试物引起神经毒性效应结论之间的关系;毒物代谢动力学信息对结论的影响;十一与其他已知神经毒剂毒性的相似性;一一试验方法可靠性和灵敏度的资料(如阳性对照和历史对照的资料h神经病理和神经功能作用之间的相互关系(如果有); 一一按性别和组别得到的亲代和子代的NOAEL或基准剂量。h) 结论一基于对试验结果整体解释的讨论，得出受试物是否引起神经发育毒性的结论及受试物的NOAEL。11 GB/T 27826-20门示19111 :
48、 附录A(资料性附录)动物分配方案举例一组20只仔鼠j(性别剂量)(每窝不同性别各1只)进行断乳前个体行为发育试验。除这些动物，10只仔鼠/性别/剂量水平(每窝不同性别各1只)在PND22人道处死，取出脑组织，称重并进行组织病理学评价。另外，从每个剂量组剩下的雌雄各10只动物取脑，进行非固定脑组织重量的测定。另一组20只小鼠j(性别剂量)(每窝不同性别各1只)进行断乳后功能/行为试验(青春期详细的临床观察、运动活性、听觉反射、认知功能试验)，并判断性发育年龄。这些动物中10只j(性别剂量)(每窝不同性别各1只)在试验终末时进行麻醉并灌注固定(约在PND70)。原位固定之后，取出脑组织，进行神经
49、病理评价。第三组20只小鼠j(性别剂量)(如每窝不同性别各1只)进行成年动物认知功能试验(如PND60-70)。这些动物中10只j(性别剂量)(如每窝一只雌性或雄性动物)在试验终止时处死，取出脑组织并称重。剩下的20只j(性别剂量)用于可能的附加试验。表A.l动物分配方案示例1仔鼠编号a试验组分配仔鼠的数量检查/试验口11 5 20 m+20 f 行为个体发育10 m十10f PND 22脑重量/神经病理/行为测试10 m十10f PND 22脑重量2 6 20 m十20f 详细的临床观察20 m十20f 运动活性20 m+20 f 性成熟20 m+20 f 运动和感受功能20 m+20 f 学习和记忆(PND25) 10m+10f 成年脑重量/神经病理/行为测试-PND703 7 20 m十20f 学习和记忆(成年)10m+10f 成年脑重-PND70 保留叩的l4 8 动
