1、ICS 13. 300; 11. 100 A 80 道雪和国国家标准11: ./、中华人民GB/T 27828-2011 化学晶体外皮肤腐蚀经皮电阻试验方法Chemicals-Test method of in vitro skin corrosion 一Transcutaneous electrical resistance test(TER) 2011-12-30发布2012-08-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 27828-2011 目IJ1=1 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准与经济合作与发展组织OE
2、CD化学品测试指南No.430(2004)(体外皮肤腐蚀:经皮电阻试验法)(英文版)技术性内容一致。本标准做了下列结构和编辑性修改:一一增加了范围一章;一一将OECDNo. 430:2004介绍部分并入了引言部分;一一删除了OECDNo. 430: 2004介绍部分中的本指南中的定义见附录;一一将OECDNo. 430: 2004初始考虑部分井入了引言部分;一一将OECDNo. 430:2004附录:定义章并入了术语和定义部分;一一计量单位改成为我国法定计量单位。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所
3、、宁波检验检疫科学技术研究院、中国检验检疫科学研究院、中国化工经济发展中心。本标准主要起草人:侯粉霞、马中春、慈颖、林铮、杨挺、陈小青、龙再浩、林振兴。I GB/T 27828-2011 引皮肤腐蚀作用是指皮肤接触受试物后所产生的不可逆的皮肤组织损伤见全球化学品统一分类和标签制度(GloballyHarmonized System of Classification and Labelling of Chemicals , GHS)中的定义JC10本标准则提供了一项不使用活体动物就可进行皮肤腐蚀性评价的试验方法。皮肤腐蚀试验通常需要使用实验动物2。在OECD化学品测试指南404的2002年修订
4、版及其增补中考虑到了该试验方法可能会对实验动物造成痛苦和伤害。因此，考虑变更为体外皮肤腐蚀试验方法以避免给实验动物造成的痛苦和伤害。完全取代动物体内皮肤腐蚀试验(OECD404)的主要困难在于还没有正式的、独立的、经确认的体外腐蚀试验方法。建立皮肤腐蚀替代试验方法的第一步应该是开展方法确认前的预验证试验时，然后才能进行正式的体外皮肤腐蚀试验叫的方法确认研究叫。根据上述有关试验的结果以及其他相关的文献资料，认为人体皮肤模型试验(OECD431)和经皮电阻试验方法(即本标准)可用于评价体内皮肤腐蚀性9-11。有关确认试验的研究结果以及其他已发表的研究资料表明大鼠经皮电阻试验方法(TER试验)12叫
5、能可靠地识别已知的皮肤腐蚀性和非皮肤腐蚀性5.9。本试验可用于鉴定化学物及其混合物的腐蚀性。另外，依据已有的信息(如pH值、结构-活性关系、人和/或动物资料)并通过证据权衡分析，本标准也可用于鉴定化学物及其混合物的非腐蚀性1-2.11.14。本标准通常不能提供受试物皮肤剌激方面的信息，也不能对腐蚀性物质按照GHS规则进一步加以分类1。为全面评价单次经皮染毒后受试物对皮肤的局部作用，建议采用一种有前后顺序的测试策略(见OECD 4042和GHSI勺。该测试策略包括先进行体外皮肤腐蚀试验和体外皮肤剌激试验，然后再考虑使用活体动物进行试验。E 1 范围化学晶体外皮肤腐蚀经皮电阻试验方法GB/T 27
6、828-20门本标准规定了化学品体外皮肤腐蚀经皮电阻试验方法的术语和定义、试验原理、试验方法、试验数据和报告。本标准适用于经皮电阻体外皮肤腐蚀试验。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1 体内皮肤腐蚀skin corrosion in vivo 皮肤接触受试物4h后产生的不可逆损伤，即从表皮到真皮出现了可见性坏死。腐蚀性作用的特征有:溃痛、出血、血性结脯，14d后表现为皮肤萎缩褪色、局部斑秃和结癫等改变。对于可疑的皮肤损伤要进行组织病理学检查。2.2 经皮电阻transcutaneous electrical resistance , TER 皮肤的电阻抗性，用电阻值CkO)来表示
7、。采用惠斯登电桥来记录皮肤对离子的通透性，是一种简单稳定的评价皮肤屏障功能的方法。3 试验原理将受试物涂敷到置于两层测试系统中的表皮表面，保持24ho在该测试系统中，层与层之间的试验用皮肤可作为一个独立的功能层。试验用皮肤来自于经安乐处死的28日龄30日龄的大鼠。根据皮肤角质层缺失的程度及皮肤屏障功能的减低CTER低于阔值)情况来鉴定受试物是否具有腐蚀性12J。大量化学物的大鼠TER测试结果表明，大多数TER值远远高于5ko C常大于10ko)或低于5kOC常小于3ko) ，故将判定大鼠皮肤腐蚀与否的TER临界值定为5kO12J。通常，对活体动物皮肤元腐蚀性的物质，无论是否具有刺激性，测定的T
8、ER值一般不低于5kO。此外，使用不同的皮肤或不同的试验装置时，TER临界值可能发生改变，此时，需要进一步验证。本试验程序中加入了染色方法，以确认阳性结果(包括TER值接近5kO时)。如果角质层遭到了破坏，则会增加离子的通透性，从而可用染色方法进行验证。已有证据证明，采用大鼠皮肤进行的TER试验可预测家兔体内腐蚀性试验COECD 4042J)结果。需要指出的是，采用家兔体内试验进行皮肤腐蚀性和皮肤剌激性的检测结果与人体皮肤斑贴试验的结果具有高度的一致性旧。4 试验方法4. 1 实验动物已有研究证明大鼠皮肤对化学物更敏感，故选用大鼠皮肤进行试验10J。所用大鼠的鼠龄和品系很GB/T 27828-
9、2011 重要，以确保用于试验的大鼠皮肤处于毛发尚未开始生长前的毛囊休眠阶段。选用约22日龄的Wistar大鼠(或其他相近品种)，雌雄皆可。用小剪刀仔细剪掉大鼠背部和侧腹部毛发。然后小心擦拭动物。同时把染毒部位涂抹抗生素溶液(如含有效浓度的链霉素、青霉素、氯霉素和两性霉素溶液，以抑制细菌生长)，3d4d后用抗生素溶液再清洗动物一遍。如剪毛后角质层已经恢复正常，在第二次清洗后3d内，动物可用于试验。4.2 试验用皮肤的制备在大鼠为28日龄30日龄(该年龄非常关键)时将其处以安乐死。取下每只动物的背侧部皮肤并小心去除多余的皮下脂肪，制成直径大约为20mm的试验用皮肤。试验用皮肤可采用适当方法贮存备
10、用，因为大量试验结果证明，贮存之后试验用皮肤的阳性对照和阴性对照的数据与新鲜皮肤获得的数据相同。将试验用皮肤置于聚四氟乙烯(PTFE)管的一端，并使皮肤的表皮面朝向PTFE管并与其接触。再用0形橡胶环将试验用皮肤压紧并固定在PTFE管的底部，剪去多余的皮肤。PTFE管和0形橡胶环的规格(见附录A中A.l)。用凡士林将0形橡胶环与PTFE管端密封。用弹簧线夹将PTFE管固定在一个装有硫酸镜溶液(154mmol/L)的接收管中(见附录B中B.1)，并使PTFE管下端的试验用皮肤完全浸入硫酸镜溶液中。每只大鼠的皮肤可制备10块15块试验用皮肤。试验开始前，分别从每只动物制备的试验用皮肤中取两片进行电
11、阻测定以进行质量控制。这两块试验用皮肤的电阻均须大于10kn时才可使用剩余的试验用皮肤进行试验。如果低于10kn，则由该只动物的皮肤制成的试验用皮肤都不能用于试验。4.3 受试物和对照物的染毒每次试验应同时设立阳性对照和阴性对照以确保试验系统处于正常状态。应使用来自同一只动物的试验用皮肤。建议阳性对照使用10mol/L的盐酸、阴性对照使用蒸馆水。试验时，将150L液态受试物均匀地涂敷于PTFE管内的试验用皮肤表面。如果受试物是固体，则应加入足够量的受试物均匀地铺到试验用皮肤上以保证整个外皮的表面都被覆盖，再向固体受试物表面加150L去离子水并轻轻摇动管子，混匀。为使固体受试物与皮肤达到最有效的
12、接触，应将受试物加热至30.C使其熔解或软化，或将受试物研磨成细粉状。试验时每个试验组和对照组要使用3个试验用皮肤。受试物应在20.C 23 .C条件下染毒皮肤24 h后，用30.C水将试验用皮肤上的受试物冲洗干净。4.4 TER测定采用低电压交流惠斯登电桥(Wheatstonebridge)测定皮肤阻扩:I!PTER(经皮电阻)凶。通常惠斯登电桥的工作电压是1V3 V，正弦披或三角波惠斯登电桥的交流电频率为50Hzl 000 Hz，测量范围至少为O.1 kn30 kn.在验证试验中使用的电桥在频率100Hz或1000Hz(可以串联也可以并联)时，其电感系数、电容、电阻的应能分别达到2000H
13、、2000F和2Mn的上限。进行TER腐蚀性测定时，测量结果以频率为100Hz、串联条件下的电阻值来表示。测量电阻前，应在试验用皮肤上涂敷足够量的70%酒精以降低皮肤的表面张力。几秒钟后去除酒精并加入154mmol/L硫酸镜溶液3mL使皮肤组织水化。将电桥的电极放置于试验用皮肤的两侧、测量电阻值(kn/试验用皮肤)(见附录B中B.l)。电极的直径和位于鲤鱼嘴夹夹距以下部分的电极长度见图A.1。电阻测量过程中，要将夹持内电极的鳝鱼嘴夹置于PTFE管顶端以确保浸泡在硫酸镜溶液中的电极长度保持不变。将外电极插入到接收管底部。PTFE管上的弹性回形针和底部的距离应保持不变(见附录A中A.l)，因为这个
14、距离会影响电阻的测量值。因此，内电极与试验用皮肤之间的距离也应保持不变并且要尽量短(1mm2 mm)。GB/T 27828-2011 如果测量所得的电阻值大于20kn时，可能是由于试验用皮肤上残留有受试物所致，应进一步除去这些残留的受试物，例如可用戴手套的拇指堵住PTFE管，摇晃约10s，弃去管内的硫酸侯溶液并加入新鲜的硫酸镜溶液后再次测量电阻。试验装置的性能、大小以及所使用的试验程序可影响TER值。判断腐蚀性的5kn临界值仅适用于在本方法要求的试验装置和试验程序条件下测量的TER值判定。如果改变试验条件或使用不同的试验装置，则可以选择不同的闰值。因此，有必要从用于验证试验的化学物质4-5J中
15、或从与受试物类似的物质中选择一系列的参照物质进行试验，借以对试验方法和电阻闰值进行矫正。一些推荐的合适化学物质参见附录C.4.5 染色方法某些非腐蚀性物质可使TER值降低至5kn临界值以下，因为这些物质可让离子通过角质层从而降低电阻问。例如，中性有机物和具有表面活性的化学物质(包括去污剂、乳化剂和其他表面活性剂)能去除皮肤上的脂质从而增加皮肤的离子通透性。因此，如果受试物的TER值低于或接近5kn但没有肉眼可见的皮肤损伤时，则对照组和染毒组都应进行染料渗透试验以确定TER值的降低是由于皮肤渗透性增高引起还是由于皮肤腐蚀引起叫。由于后者常常会导致皮肤角质层损伤，当在皮肤表面加入硫酸若丹明B染料后
16、，染料会迅速渗透皮肤角质层并使下面的皮肤组织染色。这种染料对很多种化学物质稳定，且不受后续的萃取试验影响。4.6 疏酸若丹明B染料的应用与清除4.6. 1 测定TER后，去除硫酸镜溶液，并仔细检查皮肤有无明显损伤。如没有观察到明显损伤，则要在试验用皮肤上加入10%(质量/体积)的硫酸若丹明B(酸红52;C.1. 45100;CAS号3520-42-1)水溶液150L，作用2h后，用温度至少为室温的自来水冲洗表皮约10s以去除多余或未结合的染料。4.6.2 小心地从PTFE管上取下试验用皮肤并放入装有8mL去离子水的瓶中(例如20mL的玻璃闪烁瓶)，轻轻震摇5min以去除多余或未结合的染料。重复
17、上述清洗步骤后，将试验用皮肤移入装有5 mL 30%(质量/体积)的十二烧基硫酸铀(SDS)蒸锢水溶液的瓶中，60.C孵育过夜。4.6.3 孵育后，取出试验用皮肤并将其丢弃。将剩余溶液在21.C离心8min(相对离心力为175g)。吸取1mL上清液并用30%SDS溶液稀释到原体积的5倍，测量榕液在565nm的光密度(D)。4. 7 计算染料含量可通过D值来计算每块试验用皮肤中硫酸若丹明B染料的含量5J(硫酸若丹明B染料在565nm 处的摩尔消光系数是8.7X104;相对分子质量为580)。用合适的标准曲线得出每块试验用皮肤的染料含量，并根据重复测定值(平行测定值)来计算每块试验用皮肤染料的平均
18、含量。4.8 结果解释4.8. 1 如果阳性对照和阴性对照的TER测定值在表1要求的范围内，则可认为试验的结果是可信的。表1电阻抗范围对照组物质电阻范围/kn阳性10 mol/L盐酸0.5-1. 0 阴性蒸馆水10-25 3 G/T 27828-2011 4.8.2 如果阳性对照和阴性对照的染料与试验用皮肤的结合量在表2要求的范围内，则可认为试验的结果是可信的。表2染料量范围对照组物质染料含量范围/Cg/试验用皮肤阳性10 rnol/L盐酸40-100 阴性蒸馆水15-35 二4.8.3 符合下列情况可认为受试物对皮肤不具有腐蚀性za) 受试物的TER平均值大于5kn;或者b) TER平均值低
19、于或等于5kn，并且一一试验用皮肤未见明显的损伤;而且一-试验用皮肤的染料含量均值低于10mol/L盐酸阳性对照的染料含量均值(见4.8.2中的可接受范围)。4.8.4 符合下列情况则可认为受试物对皮肤具有腐蚀性:a) 受试物的TER均值低于或等于5kn并且皮肤有明显的损伤;或者b) TER均值低于或等于5kn，并且一一试验用皮肤没有明显的损伤;但是一一试验用皮肤的染料含量均值高于或等于10mol/L盐酸阳性对照的染料含量均值(见4.8. Z中的阳性对照值)。5 试验数据军日报告5. 1 数据以表格的形式列出受试物组、阳性对照组和阴性对照组的电阻值(k)和试验用皮肤染料含量均值(g/试验用皮肤
20、)(单个试验数据和平行组的均值)，还应列出重复测定的每个测定值和均值。5.2 试验报告试验报告应包括以下信息:a) 受试物和对照物:1) 化学名(如IUPAC或CAS名称)及CAS号;2) 化学物质或其制剂组分的含量(质量分数)、纯度和物理性质53) 理化特性(如物理状态、pH值、稳定性、水溶性); 4) 试验前对受试物和对照物的处理(例如加热、研磨等); 5) 稳定性(如已知就在报告中提供)。b) 实验动物:1) 动物品系和性别z2) 动物的年龄;3) 动物的来源、饲养条件及饲料等;4) 皮肤制备的细节。4 c) 试验条件:1) 试验系统的标准曲线;2) 染料含量测定标准曲线;3) TER测
21、量的详细试验步骤;的染料含量测定的详细试验步骤(需要时); 5) 对试验程序做任何修改的描述;的腐蚀性作用判断标准。d) 结果:GB/T 27828-2011 1) 以表格形式报告每只动物及每块试验用皮肤的TER值和染料结合量的数据表格;2) 观察到的任何症状。e) 讨论。f) 结论。5 GB/T 27828-20门附录A(规范性附录)聚四氟乙烯(PTFE)管尺寸示意图A.l 聚四氟乙烯(PTFE)管的尺寸(见图A.1)。0.5 0.5 / 弹簧线夹75 -一-一16一-o 二78 95 0型圈位置图A.l聚四氟乙烯(PTFE)管尺寸示意图6 单位为毫米GB/T 27828-2011 附录B(
22、规范性附录)鼠皮肤TER测试器具示意固B.1 鼠皮肤TER测试器具的示意图(见图B.D。弹簧线夹内电极(粗)PTFE管弹簧夹接收管硫酸镶(154mmoVL 试验用皮肤表皮0型橡胶环硫酸钱(154mmoVL) 图B.1鼠皮肤TER测试器具示意图7 GB/T 27828-2011 附录C(资料性附录)参考物质C.1 表C.l给出了相应的参考物质。表c.1 参考物质化学品名化学文摘服务社编号1，2-二氨基丙烧78-90-0 丙烯酸79-10-7 2-叔丁基苯盼88-18-6 氢氧化饵(10%)1310-58-3 硫酸(10%)7664-93-9 辛酸(正辛酸)124-07-02 4氨基1，2，4-三
23、略584-13-4 丁香盼97-53-0 澳乙基苯103-63-9 四氯乙烯127-18-4 异硬脂酸30399-84-9 4-甲基硫代苯甲醒3446-89-7 腐蚀程度严重腐蚀严重腐蚀腐蚀腐蚀腐蚀腐蚀无腐蚀无腐蚀元腐蚀元腐蚀元腐蚀元腐蚀C.2 表C.l所列的大部分化学物均来自于欧洲替代方法验证中心(theEuropean Centre for the Vali dation of Alternative Methods , ECV AM)国际一致性研究所选用的化学物列表。选择上述物质的标准如下za) 相同数量的腐蚀性和非腐蚀性物质;b) 涵盖大多数化学品种类，并且可通过商业途径获取的化学物质
24、;c) 包含了严重腐蚀性和轻微腐蚀性的化学物，以保证对腐蚀能力加以区别;d) 所选择的化学物除了具有腐蚀性外，可以在实验室里正常使用，没有其他严重的危害。8 GB/T 27828-2011 参考文献lJ OECD(2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environ mental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Num ber 33. ENV /JM/MONO
25、(2001)6 , Paris http:/www. olis. oecd. org/olis/2001doc. nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001) 6 2J OECD(2002). OECD Guideline for Testing of Chemicals. No. 404: Acute Dermal Irritation, Corrosion, revised version, as adopted on 24 April 2002 ,7 pp plus Annex and Supplement 3J Botham, P. A. , Chamberlain, M.
26、 , Barratt, M. D. , Curren,R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner,J. R. ,Gordon, V. C. , Hildebrand，丘，Lewis，R. W. , Liebsch, M. ，Logemann，丑，Osborne，R. , Ponec, M. ,Regnier, J .丑，Steiling，W. ,Walker,A. P. ,and Balls , M. (1995). A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and rec
27、ommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23 ,219-255 4J Barratt，M.丑，Brantom，P.G. ，Fentem，.旺，Gerner ,I. , W alker , A. P. , and W orth, A. P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12
28、,471-482 5J Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls , M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile，D.上，Holzhtter，H. -G. ,and Liebsch,M. (1 998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic. in
29、 Vitro 12 ,483- 524 6J OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods , 62pp 7J Balls, M. ,B!aauboer, B. J. , Fentem.J. H. , Bruner. L. ,Combes ,R. D. ，Ekwall，丘，Fielder. R.上，Guillouzo，A. , Lewis, R. W.
30、, Lovell , D.丑，Reinhardt，C. A. , Repetto, G. ，Sladowski.丘，Spiel mann, H. ,and Zucco , F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. The report and rccommcndations of ECV AM workshops. ATLA 23 ,129-147 8J ICCVAMCInteragency Coordinating Committee on the Validation of Alt
31、ernative Methods). (199 7). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences ,Research Triangle Park,NC, USA. http:/iccvam. niehs. nih. gov/ docs/ guidelines/validate. pdf 9J ECVAM(1998). ECVAM News &
32、. Views. ATLA 26 ,275-280 10J ICCVAM CInteragency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Meth ods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm ,EPISKIN(EPI-200) ,and the Rat Skin Transcuta neous Electrical Resistance ( TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity pot
33、ential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods , National Institute of Environmental Health Sciences,Research Triangle Park,NC, USA. http:/iccvam. niehs. nih. gov / methods/ epiddocs/ epis_brd.
34、pdf 11J OECD(2002)Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st-2nd November 2001 , Secretariat s Final Summary Report, 27由March2002 , OECD ENV /EHS, available upon request from the Secretariat 12J Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. , and R
35、hodes , C. (1986). An in vitro skin corrosivity test-modifications and validation. Fd. Chem. Toxicol. 24 ,507-512 9 G/T 27828-2011 13J Botham,P. A. , Hall,T.J. ，Dennett，R.，如1cCall，J. C. , Basketter, D.儿，Whittle，丑，Cheeseman, M. , Esdaile ,D. J. , and Gardner ,J. (1992). The skin corrosivity test in v
36、itro : results of an in terlaboratory trial. Toxic. in Vitro 6,191-194 14J Worth AP,FentemJH ,Balls M , Botham PA, Curren RD, Earl LK, Esdaile DJ , Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709-720 15J Basketter, D.人，Chamberlain, M. , Griffith
37、s , H.儿，Rowson, M. , Whittle, E. , York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35 , 845-852 16J Oliver G. J. A , Pemberton M. A and Rhodes C. (1988). An In Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial Validation. Toxic. in Vitro.
38、2 ,7-17 10 FFON|NhNH阁。国华人民共和国家标准化学晶体外皮肤腐蚀经皮电阻试验方法GB/T 27828-2011 中唔中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1字数21千字2012年5月第一版2012年5月第一次印刷唔书号:155066. 1-44600 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价打印日期:2012年6月18日F002
