1、ICS 11. 220 B 41 道昌中华人民=lI工./、和国国家标准GB/T 27981-2011 牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法Real-time PCR method for the detection of infectious bovine rhinotracheitis virus 2011-12-30发布2012-06-01实施数E马/J伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 27981-2011 目IJr:I 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准参考了OIE发布的陆生动物诊断试验和疫苗手册)(2008版)
2、关于牛传染性鼻气管炎/牛传染性化服性外阴阴道炎(Chapter2.4.13)的内容。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人:陈茹、刘中勇、林志雄、罗琼、曾碧健、许如苏、姜巍、吴晓薇。I 1 范围牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法GB/T 27981-2011 本标准规定了牛传染性鼻气管炎病毒(牛癌彦病毒I型，BoHV-l)实时荧光PCR检测方法的技术要求。本标准适用于快速检测牛血样、拭子、精液、动物组织(粘膜、肝、脾、肾、淋巴结、胎盘组织等)和细胞培养物等样
3、品中BoHV-1病毒感染。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法世界动物卫生组织(OIE)(陆生动物诊断试验和疫苗标准手册(2008版)关于检测牛冷冻精液中BoHV-1病毒的实时荧光PCR方法3 缩略语下列缩略语造用于本文件。BoHV-1 : bovine herpesvirus type 1，牛殖菇病毒I型。Ct值:荧光信号量达到设定的阔值时所经历的循环数。DNA:deoxyribonucleic acid，脱
4、氧核糖核酸。DTT: DL-dithiothreitol，二硫苏糖醇。EDT A: ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胶四乙酸。IBR: bovine infectious rhinotracheitis，牛传染性鼻气管炎。PBS: phosphate buffer solution，磷酸盐缓冲生理盐水。PCR: polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。SDS: sodium dodecyl sulfate，十二烧基磺酸铀。UDG酶:uracil DN A glycosy lase，尿嘈睫DNA糖基化酶。4 设备和器材4. 1 荧
5、光PCR仪。4.2 台式冷冻离心机。4.3 可调微量移液器:规格10L、100L、200L、1mL。4.4 带滤芯微量吸头:规格10L、100L、200L，lmL. 4.5 PCR光学反应管。4.6 微量离心管。4. 7 涡旋混匀器。4.8 恒温培养箱。4.9 冰箱:规格2.C8 .C，一20.C，一80.C。1 G/T 27981-20门4. 10 恒温水浴箱。5试剂除另有规定，本方法试验用水应按照GB/T6682中规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。5. 1 引物与探针引物与探针配制采用无DNA酶、元RNA酶水将每条引物与探针配制成100fLmol/L储存液，置一200C或更低温度冻存;
6、使用时取适量配制成10mol/L工作液，避免多次冻融。引物与探针序列zgB基因上游引物gB-F:5TGTGGA CCT AAA CCT CAC GGT 3 gB基因下游引物gB-R:5GTAGTC GAG CAG ACC CGT GTC 3 gB基因探针:5FAM-AGGACC GCG AGT TCT TGC CGC BHQ-1 3 探针5端标记的报告荧光基团及3端标记的摔灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选定。5.2 蛋白酶K溶液:配制方法见附录Ao5.3 拧橡酸铀缓冲液z配制方法见附录A。5.4 0.5 mol/L EDTA:配制方法见附录Ao5.5 0.01 mol/L pH7.
7、 2 PBS;配制方法见附录Ao5.610%chelex100:配制方法见附录Ao5. 7 1 mol/L DTT:配制方法见附录A。5.8 2 X定量PCR-UDG酶预混液:含60U/mL热启动Taq酶，40mmol/L Tris-HCl (pH8.的，100 mmol/ L KCl , 6 mmol/L MgC12, 400mol/L dGTP , 400mol/L dA TP , 400mol/L dCTP, 800 fL mol/L dUTP ,40 U/mL UDG。可采用经验证可靠的商品化预混液。5.9 核酸抽提试剂盒。5.10 元DNA酶、无RNA酶水。5. 11 元水乙醇。5.
8、12 70%乙醇:用新开启的无水乙醇和无DNA酶、无RNA酶水配制，-20oC预冷。5. 13 三制甲:皖。5.14 异丙醇。6 样品采集与处理6.1 样品采集及前处理6. 1. 1 采样工具采样工具需经(121士2)OC/0.1MPa高压15min并烘干，或经160oC干炜2h灭菌。6. 1. 2 血清、全血用元菌注射器或采血专用真空管针元菌自牛静脉采血，元菌分离血清，直接用于核酸提取。用元菌注射器或采血专用真空管针元菌自牛静脉采血，将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用拧朦酸铀缓冲液，或0.5mol/L EDTAo每6mL血液加1mL抗凝剂。直接用于核酸提取。6. 1
9、. 3 拭子用元菌棉拭子采集鼻道、生殖器官和眼分泌物，采集时，将拭子反复刮擦呼吸道或生殖器官粘膜，蘸2 GB/T 27981-2011 取分泌物后，立即将棉拭子浸入1mL2 mL灭菌O.01 mol/L pH7. 2的PBS中，4.C储存，尽快送达实验室。取样进行检验时，充分振动、挤干拭子，浸泡液采用4000 r/min离心1min，取上清备用。6. 1. 4 精液将冷冻精液样品或新鲜精液样品分装到1.5 mL微量离心管中，充分解冻后，振荡混匀，采用12 000 r/min离心30s，取上清按6.2.1或6.2.3进行核酸提取;或取原液按6.2.2或6.2.3提取核酸。每一批次冷冻精液取3支冻
10、精管，分别进行核酸提取和后续检测。6. 1. 5 组织样品剖检时元菌采集动物呼吸道粘膜、扁桃腺、肺部和支气管淋巴结，对流产胎儿，采集刚死亡胎儿肝、肺、肾、脾和胎盘组织。检测时，用无菌剪、慑取适量样品，按1: 5的比例加入灭菌0.01mol/L pH7. 2 的PBS(例:1g组织样品加5mL溶液)，在研钵中剪碎，充分研磨，取研磨物分装到离心管中，冻融2次3次，4000 r/min离心5min，取上清备用。6.1.6 细胞培养物细胞培养物冻融2次3次，分装到1.5 mL微量离心管中，4000 r/min离心1.min，取上清备用。6.2 样品核酸抽提6.2.1 有机溶剂抽提法适用于上述各种样品。
11、取200L经前处理的样品或对照，加200LO. 01 mol/L pH7. 2 PBS缓冲液，加SDS、蛋白酶K至终浓度分别为1%和0.5mg/mL，混匀器上振荡混匀，56.C温育30min，置沸水浴孵育8min加等体积三氯甲饶，振荡混匀，12000 r/min，离JL10 min，取上清;可重复三氯甲皖处理步骤一次;加等体积异丙醇(-20 .C预冷)，振蔼混匀;4 .C , 13 000 r/min离心10min，弃上清;加等体和、70%乙醇，振荡?昆匀，4.C ,13 000 r/min离心10min;小心吸弃上清，吸头不要碰到有沉淀一面，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品需在吸水纸不
12、同地方沾干)，在沽净工作台室温干燥5min;加入50L元DNA酶、无RNA酶水，轻轻混匀，溶解管壁上的核酸，室温放置10min，直接用于检测，或贮20.C备用。长期贮存，应置一80.C或更低温度。6.2.2 Chelex 100提取法采纳世界动物卫生组织(OIE)陆生动物诊断试验和疫苗标准手册)(2008版)操作程序，适用于精液样品。在微量离心管中，加入10% chelcx 100溶液100L，蛋白酶K(lOmg/mL)11. 5L，l mol/L DTT 7.5L，90L元DNA酶、元RNA酶水，10L精液样品，充分混匀;置56.C温育30min，充分振荡混匀10S;置沸水浴孵育8min，充
13、分振荡混匀10S;用12000 r/min离心3min，取上清直接用于检测，或贮-20.C备用。长期贮存，应置一80.C或更低温度。6.2.3 试剂盒抽提法可采用经验证等效的商品化核酸抽提试剂盒方法。7 实时荧光PCR检测7. 1 对照设立7. 1. 1 样品设置要求:从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照。7. 1. 2 阳性对照:取已知阳性的同类样品作为阳性对照。也可将适量BoHV-1病毒或含阳性模板的3 GB/T 27981-20门质粒DNA添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。7. 1. 3 阴性对照:取已知阴性的同类样品作为阴性对照。7. 1. 4 空白对照:在扩增反应阶段设置。以
14、元DNA酶、元RNA酶水作为模板设置空白对照。7.2 实时荧光PCR检测7.2. 1 加样反应体系采用25L反应体积，其中，含2X定量PCR-UDG预混液12.5L，上、下游引物各200 nmol/L，探针100nmol/L，模板5L(100pglg) ，补加适量元DNA酶、元RNA酶水使反应总体积达25L.加完样后，盖紧管盖，混匀，低速瞬时离心，使反应液集中管底。7.2.2 扩增反应反应参数设置:一一-50.C2 min; 一一-95.C 2 min; 一-95.C 15 s , 60 .C 45 s，45个循环，荧光收集设置在每次循环的退火延伸时进行。荧光素或检测通道设置:采用FAM通道或
15、将报告荧光(reportdye)设定为FAM，采用其他报告荧光应按仪器说明对应设定通道;摔灭荧光(quenchdye)设定为None，校准荧光(referencedye)设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。7.2.3 结果判定7.2.3. 1 结果分析条件设定综合分析仪器给出的各项结果，基线Cbaseline)以仪器给出的默认值作为参考，阔值(threshold)设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪声情况进行调整，选择反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析。7.2.3.2 质控阴性对照和空白对照应无Ct值，阳性对照的Ct值应30且出现
16、典型的扩增曲线。如对照不满足以上条件，此次实验视为元效。7.2.3.3 荧光PCR反应结果判定在质控有效的条件下进行结果判定。阴性反应结果判定，检测结果呈现元Ct值的反应判为阴性反应。阳性反应结果判定，检测结果呈现Ct值35且扩增曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应。对于35Ct值45的样品，应进行重复试验。如果重复试验的Ct值屿，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应。否则判为阴性反应。必要时，对初次检测呈阳性反应的样品进行重复检测。8 注意事项检测过程防止交叉污染应注意的事项见附录B。4 A. 1 0.01 mol/L pH7. 2 PBS 附录A(规范性附录)溶渣的配制GB/T 2798
17、1-2011 A液(0.2mol/L磷酸二氢铀溶液):称取磷酸二氢铀(NaH2P040 H20)27. 6 g，溶于蒸锢水中，定容至1L。B液(0.2mol/L磷酸氢二铀溶液):称取磷酸氢二铀(Na2HP040 7H20)53. 6 g(或Na2HP04 0 12H20 ,71. 6 g;或Na2HP040 2H20 , 35. 6 g)加蒸馆水溶解，定容至1L。0.2 mol/L A液14 mL 0.2 mol/L B液36mL 氧化铀8.5 g 将上述体积A液与B液混合，溶解氧化纳，并用蒸馆水定容至1L，即为0.01mol/L pH7. 2 PBS 缓冲液。A.2 拧攘酸铀缓冲液拧攘酸(C
18、SH8070H20)5.3g 拧朦酸铀(Na3CsHs070 H20) 15 g 葡萄糖(CSH120S0H20)16.2g 称取上述试剂，溶解于蒸馆水，定容至1L，渥匀。采用(121士2).C/0.1MPa高压灭菌15min后贮存于4.C。A.3 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) 称取186.1g EDTA，加入800mL蒸馆水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化铀(NaOH)调pH至8.0，定容至1L，分装后采用(121士2).C/0. 1 MPa高压灭菌15min，贮室温。A.4 10% chelex 100 称取10g chelex 100树脂，加入适量灭菌双蒸水中，定容至1
19、00mL。吸取时边搅拌边用灭菌吸头移取。A. 5 1 mol/L DTT 称取3.09g D汀，加20mL O. 01 mol/L乙酸铀(pH5.2)溶解，过滤除菌，分装成小份后，一20.C 保存。A.6 蛋白酶K溶渣(10mg/mL) 称取100mg蛋白酶K加入9.5mL水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10mL。5 GB/T 27981-2011 附录B(规范性附录)检测过程防止交叉污染的措施B.1 采样及样品处理过程，应防止不同样品之间通过器具、手套等的交叉污染。采样及样品处理工具应经过高压灭菌或高温烘炜处理，一套工具仅限一个样品使用。存放样品的容器应清洗、高
20、压灭菌或高温烘烤处理，或使用一次性灭菌容器。B.2 实验过程，应穿工作服和戴一次性手套，勤换手套，工作服应经常清洗。B. 3 使用带滤芯吸嘴。吸嘴、离心管、PCR管等应经过高压灭菌处理，一次性使用，不得回收清洗后重复使用。B.4 样品处理与PCR加样应在不同的区域进行，不同区域配备独立的加样工具和用具。该区域可以是独立的空间间隔、有紫外消毒设施的独立的设备如核酸提取工作站、PCR加样工作站、可密闭进行紫外消毒的超净工作台、生物安全柜等。若在敞开的空间进行核酸提取或PCR加样，该空间应安装紫外灯或配备具有等同降解核酸功能的设备如移动紫外灯、带紫外消毒功能的空气消毒净化器等。上述区域在每次使用后应
21、及时清洁处理，并在使用前后照射紫外30min以上。每个区域应有专门的废弃物容器，该容器应能耐受煮沸、10%次氯酸铀溶液消毒处理。每次实验结束，应在紫外消毒前，及时清理废弃物及消毒容器，并将该废弃物容器放回工作区进行紫外消毒。B. 5 PCR反应液等试剂应按检测需求分装贮存，避免同一管试剂多次开启使用。B. 6 装有核酸模板、样品或试剂的离心管在打开之前，应短暂离心，避免离心管用力崩开，所有操作尽量避免产生气溶胶。B.7 上机运行前，应检查并盖紧各PCR管，以防荧光物质或模板泄漏而污染机器。B.8 应遵循基因检测实验室其他技术要求。6 FFON-hNH阁。华人民共和国家标准牛传染性鼻气管炎病毒实
22、时荧光PCR检测方法GB/T 27981-2011 国中等中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数13千字2012年3月第一次印刷开本880X12301/16 2012年3月第一版晤1号:155066. 1.44357 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 27981-2011 打印H邦J:2012年4月12H F002A
