1、ICS 11. 220 B 41 道B和国国家标准11: -、中华人民GB/T 27982一20门小反鱼兽疫诊断技术Diagnostic techniques for peste des petits ruminants 2011-12-30发布2012-06-01实施、数码防伪 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布目lJ1=1 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。GB/T 27982-2011 本标准起草单位:农业部热带亚热带动物病毒学重点实验室、中
2、国动物卫生与流行病学中心、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:包静月、吴晓东、王志亮、李林、刘春菊、王清华、赵文姬、邹艳丽、郑东霞、徐天刚、李金明、姚李四、张乐、林祥梅、吴绍强、韩雪清。I 小反鱼兽疫诊断技术1 范围本标准规定了小反鱼兽疫的临床诊断和实验室诊断的技术要求。本标准适用于小反鱼兽疫的诊断。2 规范性引用文件GB/T 27982-2011 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489-2008实验室生物安
3、全通用要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 荧光定量反转录-聚合酶链式反应real time quantitative reverse transcription polimerase chain re action 荧光定量RT-PCR反应在RT-PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。3.2 荧光域值threshold 荧光定量RT-PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3个-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。3.3 Ct值Ctvalue 每个反应管内
4、的荧光信号到达设定的荧光域值时所经历的循环数。4 生物安全措施进行小反鱼兽疫实验室检测时，如病毒分离、血清处理等，按照GB19489一2008。5 临床诊断5. 1 1临床症状5. 1. 1 突然发热，第2天第3天体温达40oC42 oC高峰。发热持续3d左右，病羊死亡多集中在发热后期。1 GB/T 27982-2011 5. 1.2 眼、鼻大量排出分泌物，最初水样的眼、鼻分泌物日益增多，变成腋性然后结干，动物发出恶臭。由于鼻孔被凸起的结干的鳞屑覆盖，动物打喷囔和咳嗽。呼吸急促，呼吸困难，排痰性咳嗽和眼睛的卡他性分泌物。5. 1.3 口腔粘膜充血，口腔上皮和鼻腔粘膜出现大量部分粘连的极微小的略
5、灰色坏死点，坏死组织脱落后形成界线分明的浅靡烂斑。上皮破损偏好部位为嘴唇、齿跟、牙板、舌头以及母羊阴户的阴唇表面。口腔破损可能伴有大量流涎。5. 1. 4 发热2d3 d后病畜开始腹泻，伴随严重脱水、消瘦、虚脱。怀孕母羊可发生流产。5. 1.5 特急性病例在发热开始的4d6d内死亡。亚临床型病例症状较轻，病畜在生病10d14 d 以后康复。5.2 病理变化5.2.1 嘴唇充血，口腔破损程度不等，较轻的只有一处溃菇，严重的出现广泛的溃痛性及坏死性口腔炎，涉及牙板、硬膊、颊柏膜和乳突和舌头喋部背面。粘膜病变可延伸至咽部，偶尔在网胃和瘤胃交界处。5.2.2 上呼吸道粘膜可能严重充血，伴有鼻孔和气管的
6、溃踢。支气管肺炎，肺尖肺炎。5.2.3 皱胃粘膜出现严重的充血和溃烂。偶尔，整个肠道出现弥散性的充血，但是，多数情况仅局限于十二指肠、回肠、盲肠和结肠上部分。常见回盲肠瓣膜出血。大肠纵向折叠顶部偶尔出现严重的出血形成斑马样条纹。5.2.4 肠淋巴组织坏死、萎陷。肠系膜淋巴组织轻微肿大、水肿，脾可能肿胀。上呼吸道粘膜可能严重充血，伴有鼻孔和气管的溃瘤。支气管肺炎，肺尖肺炎。肺部淋巴结肿胀并水肿。5.2.5 结膜出现服性结膜炎。肾和膀脱可见充血。母羊可见阴户和阴道靡烂。5.2.6 组织学上可见肺部组织出现多核巨细胞以及细胞内嗜酸性包含体。5.3 结果判定山羊或绵羊出现上述临床症状和病理变化，羊群发
7、病率、病死率较高，传播迅速，可判定为疑似小反鱼兽疫。6 实验室诊断6. 1 样晶采集与运输6. 1. 1 样晶的采集6. 1. 1. 1 每个发病羊群最少选择5只病畜采集样品。6. 1. 1. 2 选择处于发热期(体温40C41 .C)、排出水样眼分泌物、出现口腔溃菇、无腹泻症状的活畜采集样品。采集结膜棉拭子2个、鼻粘膜棉拭子2个、颊部粘膜棉拭子1个，分别放在300L灭菌的0.01 mol/L pH7. 4磷酸盐缓冲液CPBS)中。元菌采集血液10mL，用常规方法分离血清。6. 1. 1. 3 选择刚被扑杀或者死亡时间不超过24h的病畜采集组织样品。元菌采集肠系膜和支气管淋巴结各3个4个，脾、
8、胸腺、肠粘膜和肺等组织各约25g50 g，分别置于50mL离心管中。6. 1. 1. 4 肉制品取25g50 g，置于50mL离心管中。6.1.2 样晶的运输与储存6. 1. 2. 1 样品采集后，置冰上冷藏送至实验室检测。6. 1. 2. 2 血清储存应置于一20.C冰箱。2 6. 1. 2. 3 棉拭子、病料组织和肉制品储存应置于一700C冰箱。6.2 器械与设备GB/T 27982-2011 5%二氧化碳培养箱，DNA热循环仪，低温高速离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶成像系统或者紫外检测仪，实时荧光定量PCR仪，96孔高吸附性酶标板，洗瓶或者洗扳机，恒温箱，酶标仪。6.3 病毒分离与鉴定6.
9、3. 1 试验材料非洲绿猴肾(Vero)细胞，pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)(见A.1)，细胞培养液(见A.3)，细胞培养瓶。6.3.2 样晶处理棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子，加入青霉素至终浓度200IU/mL，加入链霉素至终浓度200g/mLo 37 oC作用1ho 3 000 g离心10min，取上清液300L作为接种材料。用灭菌的剪刀、慑子取大约0.5g组织样品或肉制品，置于研钵中，剪碎，充分研磨，加入5mL灭菌的0.01mol/L pH7. 4磷酸盐缓冲液(含青霉素200IU/mL，链霉素200g/mL)，制成1: 10悬液。37 oC作用1ho 3 000 g离心10min，取上
10、清液5mL作为接种材料。不能立即接种者，应将上清放一700C保存。6.3.3 样晶接种取样品上清液接种已长成单层的Vero细胞，370C恒温箱中吸附2h，加入细胞培养液，置5%二氧化碳培养箱37oC培养。6.3.4 观察结果接种后5d内，细胞应出现细胞病变效应，表现为细胞融合，形成多核体。如接种5d6 d后不出现细胞病变，应将细胞培养物盲传三代。6.3.5 病毒的鉴定将出现细胞病变的细胞培养物，按6.4RT-PCR方法和6.5荧光定量RT-PCR反应做进一步鉴定。6.3.6 结果判定样品出现细胞病变，而且RT-PCR方法或实时荧光RT-PCR方法鉴定结果阳性，则判为小反鱼兽疫病毒分离阳性，表述
11、为检出小反鱼兽疫病毒。否则，表述为未检出小反鱼兽疫病毒。6.4 RT-PCR方法6.4. 1 试剂与材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。TRIzol试剂，三氯甲烧，异丙醇，元水乙醇，DEPC处理过的水(见附录酌，反转录酶/TaqDNA聚合酶混合液，2X一步法RT-PCR反应缓冲液，1.5%的琼脂糖凝肢(见附录B),0.5 XTBE缓冲液(见附录B)，澳化乙链。3 GB/T 27982-2011 可以采用引物NP3/NP4用于小反鱼兽疫病毒核酸的检测，引物的靶基因、位置、序列和扩增产物的大小见表1.表1用于小反鱼兽症病毒RT-PCR检测的引物NP3 M一
12、叫一叫序列(5- 3) TCTCGGAAATCGCCTCACAGACTG CCTCCTCCTGGTCCTCCAGAATCT 产物引物351 bp NP4 6.4.2 样晶处理将棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子，取100L样品液至新的离心管中，加入1mL TRlzol试剂，振荡混匀，进行RNA提取。取大约100mg组织样品，剪碎后，加入1mL TRlzol试剂充分匀浆后转移至1.5 mL离心管中，进行RNA提取。6.4.3 RNA提取经TRlzol处理的样品液12000 r/min , 4 .C离心10min，取上清，静置5min.加200L三氯甲烧，振荡混匀，15s，静置2min-3 min.
13、12 000 r/min , 4 .C离心15min，取400L上层水相到新的离心管中，加400L的异丙醇，混匀，静置10min. 12000 r/min, 4 .C离心10min，去上清。加人75%乙醇1mL，混匀，12000r/min, 4 .C离心5min，去上清。再加入75%乙醇1mL，混匀，12000r/min, 4 .C 离心5min，去上清。干燥RNA沉淀后加入100LDEPC处理过的水溶解。立即进行RT-PCR反应或一70.C保存。6. 4. 4 RT-PCR反应反应体系为25L.依次加人以下成分:12.5L2X一步法RT-PCR反应缓冲液，1L正向引物NP3 (10mol/L
14、)，lL反向引物NP4(10mol/L) ，1L反转录酶/TaqDNA聚合酶混合液，4.5LDEPC处理过的水，5LRNA模板。每次进行RT-PCR反应时均设标准阳性、阴性及空白对照。标准阳性用阳性对照RNA作为模板，标准阴性用Vero细胞RNA作为模板，空白对照用DEPC处理过的水作为模板。RT-PCR反应条件为:50.C反转录30min; 94 C, 2 min进行Taq酶的激活;94 .C , 30 s , 55 .C , 30 s , 72 .C , 30 s，共35次循环;72 .C延伸7min. 6.4.5 PCR产物的电泳取PCR产物5L在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系
15、统中观察结果。6.4.6 质控标准小反鱼兽疫病毒RT-PCR标准阳性对照有大小为351bp的特异性阳性扩增条带，标准阴性对照和空白对照元任何扩增条带，说明质控合格。6.4.7 结果判定样品有大小为351bp的特异性阳性扩增条带判为RT-PCR结果阳性，表述为检出小反鱼兽疫病毒核酸。4 GB/T 27982-20门样品元特异性的阳性扩增条带判为RT-PCR结果阴性，表述为未检出小反鱼兽疫病毒。6.5 荧光定量RT-PCR反应6.5. 1 试验材料TRIzol试剂，三氯甲烧，异丙醇，元水乙醇.DEPC处理过的水(见附录B)、2X一步法荧光RT-PCR反应缓冲液.TaqDNA聚合酶，反转录酶，参比荧
16、光ROXII。引物和探针z引物和探针针对小反鱼兽疫病毒N基因保守序列区段设计，引物和探针的位置和序列见表20表2用于小反氢兽瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测的引物和探针引物目的位置序列(5- 3) PPRN8a 正向引物1213-1233 CACAGCAGAGGAAGCCAAACT PPRN9b 反向寻|物1327-1307 TGTTTTGTGCTGGAGGAAGGA PPRN10P 探针1237-1258 F AM-5-CTCGGAAATCGCCTCGCAGGCT -3-T AMRA 6.5.2 RNA提取同6.4.306.5.3 荧光定量RT-PCR反应反应体系为25L.依次加入以下成分
17、:12. 5L 2 X 1 st巳pbuffer.1L正向引物PPRN8a(10mol/L) .1L反向引物PPRN9b(10mol/L) .0.5L探针PPRN10p(10mol/L) .0. 5LTaq DNA聚合酶.0.5L反转最酶.0.5L参比荧光ROX11. 3.5L DEPC处理过的水.5LRNA模板。每次进行荧光定量RT-PCR时均设标准阳性、阴性及空白对照。标准阳性用阳性对照RNA作为模板，标准阴性用Vero细胞RNA作为模板，空白对照周DEPC处理过的水作为模板。荧光定量tRT-PCR反应条件为:42oc反转录30min; 95 oC. 10 min进行Taq酶的激活;95
18、C. 15 s.60 C. 1 min，共50次循环;每个循环在60oC. 1 min时收集荧光信号。6.5.4 质控标准读取每个样品的Ct值。标准阳性对照样品有特异性扩增曲线而且Ct值30.标准阴性对照和空白对照无特异性扩增曲线，说明质控合格。6.5.5 结果判定样品有特异性扩增曲线而且Ct值40判为实时荧光RT-PCR扩增阳性，表述为检出小反鱼兽疫病毒核酸。样品Ct值40或者元特异性扩增曲线判为实时荧光RT-PCR扩增阴性，表述为未检出小反鱼兽疫病毒核酸。6.6 竞争ELISA方法6.6. 1 试验材料包被用抗原:PPRV疫苗株重组N蛋白。对照血清z强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清。单克隆
19、GB/T 27982-2011 抗体:小反鱼兽疫病毒N蛋白的单克隆抗体。酶结合物z辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠血清。封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物溶液及终止液，配制方法见附录c.6.6.2 抗原包被PPRV重组N蛋白用包被缓冲液1: 3 500倍稀释后，每孔50L包被96孔酶标板，37.C置湿盒吸附1h，用洗涤缓冲液洗板4次。6.6.3 血清加样步骤每孔加入45L封闭缓冲液。每份待检血清做2孔，每孔加入5L待检血清。设强阳性血清对照孔(C+)4个，每孔加入5L强阳性血清，设弱阳性血清对照孔(C+)4个，每孔加入5L弱阳性血清，设阴性血清对照孔(C一)2个，每孔加人5L阴性血清，设单抗对照孔(C
20、m)4个，每孔加入5L封闭缓冲液，设酶结合物对照孔(Cc)2个，每孔加入55L封闭缓冲液。6.6.4 单克隆抗体的加入除酶结合物对照孔外，每孔加入50L工作浓度的单抗，37.C置湿盒作用1h，用洗涤缓冲液洗板4次。6.6.5 酶结合物的加入每孔加入50L工作浓度的酶结合物，37C置湿盒作用1h，洗涤缓冲液洗板4次。6.6.6 显色与终止每孔加入50L底物溶液，37.C避光反应10min，每孔加入50L终止液。6.6.7 读值酶标仪预热15min，读取每孔492nm波长的吸光度值(OD值)。6.6.8 计算抑制率按照式(1)计算每孔(包括对照孔)的抑制率，并计算每份样品的平均抑制率。PI =10
21、0一(ODT-7- ODc) x 100 式中:PI 一一抑制率;ODT一一试验孔或对照孔OD值;ODc一一单抗对照孔OD平均值。6.6.9 质控标准结果在质控标准(见表3)范围内，则试验成立。表3小反氢兽疫竞争ELISA检测方法质控标准项目最大值Cm孔的OD值1. 500 Cc孔抑制率+105 Cm孔抑制率+20 6 最小值0.500 十95一19( 1 ) . GB/T 27982-2011 表3(续)项目最大值最小值c+孔抑制率90 81 c+孔抑制率80 51 C一孔抑制率30 5 6.6. 10 结果判定平均抑制率(PD80，判为强阳匪，50平均抑制率(PD运so，判为弱阳性，表述为
22、小反鱼兽疫血清学阳性。平均抑制率(PD50，判为阴性，表述为小反鱼兽疫抗体血清学阴性。7 综合判定凡具有6.3.6、6.4.7、6.5.5、6.6.10中任何一项阳性者，均判为小反鱼兽疫阳性。7 GB/T 27982-2011 A.1 pH7.4磷酸盐缓冲液CPBS)NaCl KCl Na2HP04 .2H20 附录A(规范性附录)病毒分离鉴定溶液的配制8.00 g 0.20 g 1. 44 g KH2 P04 O. 24 g 用HCl调节溶液的pH值至7.4，加去离子水至1000 mL，在1.034 X 105 Pa高压下蒸汽灭菌20 mino保存于室温。PBS一经使用，于40C保存不超过3
23、周。A.2 高糖型DMEM培养液高糖型DMEM碳酸氢铀CNaHC03)超纯水13. 37 g 3.7 g 1000 mL 充分溶解后，0.22m微孔滤膜过虑除菌。4.C保存。A.3 细胞培养液高糖型DMEM培养液胎牛血清950 mL 50 mL 加入青霉素至终浓度200IU/mL，链霉素至终浓度200g/mL，两性霉素B至终浓度2.5g/mL 充分混匀。4C保存。8 附录B(规范性附录)反转录聚合酶链反应溶涯的配制B.1 DEPC处理过的水DEPC 去离子水1 mL 1000 mL 充分混匀，将瓶盖拧松后置于370C放置过夜，高压灭菌。B.2 5x四E缓冲菠Tris碱54g 棚酸27.5 g
24、o. 5 mol/L EDT A 20 mL 加去离子水调整体积至1000 mL。B.3 0.5 x TBE缓冲液取100mL 5XTBE缓冲液，加去离子水调整体积至1000mL B.4 1. 5%的琼脂糖凝胶琼脂糖0.5XTBE缓冲液0.75 g 50 mL 澳化乙链溶液(10mg/mL) 2.5L GB/T 27982-2011 称取O.75 g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入50mL O. 5XTBE缓冲液，加热溶解，冷却至50 oC60 oC时加入2.5L澳化乙链溶液，倒入胶槽内自然凝固。9 GB/T 27982-2011 附录C(规范性附录)竞争酶联免瘟吸附试验溶液的配制C.1
25、包被缓冲液一一O.05 moI/L pH9. 6碳醺盐/重碳酸盐缓冲液NaZC03 NaHC03 去离子水0.318 g 0.588 g 200 mL 用O.22m膜过滤除菌，室温保存备用。C.2 洗涤缓冲灌一-pH7.4PBST (0.05%吐温-20)吐温-20pH7.4 PBS 0.5 mL 1000 mL C.3 封闭缓冲液(含3%BSA的pH7.4PBS) 制配前用白脂jl p要4液也口闭配肘封30 g 1000 mL C.4底物溶液C.4.1 A液NazHPO. 拧攘酸过氧化氢尿素去离子水临用前配制，避光4.C8 .C保存。3.682 g l. 021 g 0.06 g 100 m
26、L C.4.2 B液拧攘酸EDTA TMB (3，3-二氨基联苯胶)去离子水l. 05 g 14.6 mg 25.0 mg 100 mL 用0.45m滤膜过滤，临用前配制，避光4.C保存。C. 4. 3 用法使用时，将A液、B液按1: 1的比例氓合。C.5 终止液一-3mol/L H2S04 浓硫酸去离子水将浓硫酸缓缓加到蒸锢水中，混匀。16.5 mL 87.5 mL GBjT 27982-2011 FFON|NhNH阁。国华人民共和国家标准小反鱼兽瘟诊断技术GB/T 27982-2011 白* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1字数21千字2012年4月第一版2012年4月第一次印刷18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价 书号:155066. 1-44356 GB/T 27982-2011 打印日期:2012年5月14日F002
