1、ICS 65.160 X 87 中华人民共和国国家标准GB/T 31758-2015 烟叶和烟叶提取物中茄尼醇的测定高效液相色谱法h Determination of solanesol in tobacco leaves and the extrac臼oftobacco leaves一High performance Iiquid chromatography method 2015-11-02实施2015-07-03发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会气耳，丁、/pyff如吁GB/T 31758-2015 前-E同本标准按照GB/T1.12009给出的规则
2、起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国烟草栋准化技术委员会(SAC/TC144)归口。本标准起草单位z福建省农业科学院中心实验室、福建省三明金叶复炜有限公司、福建中烟工业有限责任公司、陕西中烟工业有限责任公司。本标准主要起草人z潘藏、J文静、罗钦、张望兴、谢卫、J泽春、黄朝章、张建平、雷东锋、王健强、涂杰峰、余华.I 1 范围烟叶和烟叶提取物中茄尼醇的测定高效液相色谱法GB/T 31758-2015 本标准规定了烟叶及烟叶提取物中游离茄尼蹲和总茄尼蹲含量的高效液相色谱测定方法.本栋准适用于烟叶及烟叶提取物中游离茄尼酶和总茄尼蹲含量的测定
3、，本方法测定烟叶中带离茄尼醇和总茄尼蹲含量的撞出限为0.0013 mg/g，定量限为0.0043mg/g; 烟膏中游离茄尼薛和总茄尼蹲含量的检出限为0.013mg/g，定量限为0.043mg/g;提取液中游离茄尼酶和总茄尼蹲含量的检出限为0.000052 mg/ g，定量限为0.00017mg/g. 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法YC/T 31烟草及烟草制品试样的制备和水分测定烘箱法3 原理用正己烧提取烟叶中
4、带离茄尼晖，用水除去杂质，离心分离，取上层榕液用流动相稀释定容，经微膜过滤后高效液相色谱仪测定，外标法定量.测定总茄尼蹲时需用氢氧化铺皂化以释放出结合态的茄尼醋。4 试剂与材料4.1 正己烧(C6Ha)。4.2 甲酶(CH，O):色谱纯。4.3 异丙酶(C3HsO):色谱纯。4.4 氢氧化铀(NaOH)。4.5 元水乙蹲(H60)。4.6 茄尼酶标准品z纯度注98%。4.7 NaOH乙蹲溶被(0.02mol/L):称取0.4g氢氧化铀(4.的，榕于无水乙醇(4.日，用无水乙蹲稀释至500 mL，贮存于聚乙烯瓶中，旋紧瓶盖。4.8 流动相z甲蹲(4.2):异丙醇(4.3)=70 : 30(体积比
5、)，使用前经滤膜(5.1)过滤。4.9 茄尼蹲标准储备榕液(0.50mg/mL) :称取50mg茄尼蹲标准晶(4.的，置于100mL容量瓶(5.的中，精确至0.0001 g，用正己烧(4.1)溶解并定容至刻度，混匀，标准储备溶液避光保存于4C冰箱备用，有效期3个月。4.10 茄尼蹲系列标准工作溶液z分别准确移取0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、5mL茄尼蹲标准储备潜被(4.9)于不同的50mL容量瓶(5.的中，用流动相(4.8)稀释并定容至刻度，摇匀，得到茄尼蹲系GB/T 31758-2015 列标准工作溶液质量浓度分别为1g/mL、5g/mL、10g/mL、20g/mL、40g
6、/mL、50g/mL)。该茄尼蹲系列标准工作溶液应即配即用。4.11 除另有规定外，所周试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682中一级水的要求。5 仪器和设备5.1 滤膜:0.22m，直径25mm的聚飘膜或相当者.5.2 涡旋振荡器。5.3 超声披清洗器z功率不低于250W.或相当的设备。5.4 离心机E不低于4000 r/min.或相当的设备。5.5 恒温振荡器z可水浴加热(0C.-.I00 C)。5.6 高效被相色谱仪z配有紫外检测器或二极管阵列检测器。5.7 电子天平z感量0.0001 g。5.8 离心管:50mL(螺旋盖), 10 mL(具塞。5.9 容量瓶1100mL.50 mL.2
7、5 mL(棕色。5.10 三角瓶:100mL(具塞、棕色。6 分桥步骤注，本章所述的操作尽可能避免阳光直射.6.1 样晶前处理6.1.1 烟叶6.1. 1. 1 试样制备按照YC/T31制备试样并测定其水分含量。6.1. 1.2 提取称取约1g试样(6.1.1.1)于50mL离心管(5.8)中，精确至0.0001 g，加入30mL正己烧(4.1).用涡旋振荡器(5.2)涡旋振荡2min.旋紧盖子，静置12h后，用超声波清洗器(5.3)于45c超声波萃取15 min，萃取功率为250W，用离心机(5.4)4000 r/min离心10min，将上层溶被移入50mL容量瓶(5.9)中。再分2次各用1
8、0mL正己烧(4.1)重复以上振荡、萃取和离心步骤，合并上层正己烧层于50 mL容量瓶(5.的中，用正己烧(4.1)定容至刻度，摇匀。6.1. 1.3 潜离茄尼醇测定试样处理移取4mL提取液(6.1.1.2)于10mL离心管(5.8)中，加入约6mL蒸锢水，涡旋振蔼3min，去除水溶性杂质.4000 r/min离心10min分层。准确移取1mL净化后上层正己烧提取攘，用流动相(4.8)稀释并定容至25mL容量瓶(5.9)中(如茄尼蹲浓度超出标准曲线线性范围，则适当调整分取体积和定容体飘)，经滤膜(5.1)过滤，撞液待上机测定。6.1.1.4 总茄尼醇测定试样处理准确移取4mL提取液(6.1.1
9、.2)于100mL三角瓶(5.10)中，加入4mL NaOH乙醇溶液(4.7)，充2 GB/T 31758-2015 分混匀，轻塞塞子，在恒温振荡器(5.的中60.C-65 c水浴振荡、皂化2h;皂化后榕掖在83.C-87C水浴蒸发至近干p准确移取2mL正己统于上述三角瓶中，超声2min溶解残渣，转移至另一洁净10mL 离心管(5.8)中。重复以上自准确移取2mL正己烧起依法操作，需解三角瓶中残留物转移至离心管(5.8)中，再用约6mL水，每次2mL分三次洗涤三角瓶，合并稽被于离心管(5.的中p涡旋振荡离心管3min以去除水溶性杂质，离心10min分层z准确移取1mL净化后上层正己烧提取液，用
10、流动相(4.8)稀释并定容至25mL容量瓶(5.的中如茄尼酶榷度超出标准曲线线性范围，则适当调整分取体视和定容体积)，经滤膜(5.1)过撼，滤液待上机测定。6.1.2 烟叶提取物(烟膏、提取攘等6. 1.2.1 姻膏(烟叶的正B豌或石油酶提取浓缅物)称取约0.1g烟叶提取物置于10mL烧杯中，精确到0.0001 g，用正己烧榕解，转移至50mL容量瓶(5.的中，用正己烧定容，摇匀。同6.1.1.3和6.1.1.4测定烟膏中游离茄尼西事和总茄尼西事。6.1.2.2 提取渡(烟叶的乙醇水溶灌提取浓锚物6.1.2.2.1 游离茄尼醇称取约1g浓缩液，精确到0.0001 g，用流动相(4.8)稀释并定
11、容至50mL容量瓶(5.的中。超声波萃取10min，用离心机(5.4)4000 r/min离心10min.上层清液经滤膜(5.1)过滤，滤掖待上机测定。6.1.2.2.2 总茄尼醇准确移取4mL以上上层清液，于100mL=:角瓶(5.10)中，加入4mL NaOH乙醇癖液(4.7).充分混匀，轻塞塞子，在恒温振荡器(5.5)中60C -65 .C水潜振荡、皂化2h;皂化后溶液在83.C ., 87 .C水浴蒸发至近干:准确移取2mL流动相(4.8)于上述三角瓶中，超声2min溶解残渣，转移至另一洁净10 mL离心管(5.8)中。重复以上自准确移取2mL流动相(4.8)起依法操作，溶解三角瓶巾残
12、留物转移合并至离心管(5.8)中，离心10min.上层清被经滤膜(5.1)过滤，撞被待上机测定。6.2 样品测定6.2.1 高效灌相色谱参考条件按照制造商操作手册运行高效液相色谱仪。.6)。以下分析条件可供参考，采用其他条件应验证其适用性z一一色谱柱:Cl80150mmX4.6 mm(内径).拉径3m.或性能相当者$一一柱温:40.C;一一紫外检测波长:213nm; 一一流速:1.0mL/min; 一一进样体棋:20衅。6.2.2 灌相色谱副寇分别取适量的茄厄障系列标准工作溶液(4.10)及待上机试样需液，按6.2.1列出的条件进行液相色谱分析测定.由保留时间进行定性，根据标准工作榕液的浓度及
13、茄尼酶响应峰面砚，建立标准工作曲线。工作曲线线性相关系数R2注0.999.3 GB/T 31758-2015 待测样被中茄尼酶的响应值应在标准曲线范围内，超过线性范围则应稀释后再进行分析。分析过程中，每201X样品测定后应加入一个与样晶峰面积相近的标准工作液，如果测得的值与原值相对平均偏差超过5%，则应重新进行标准曲线的制作。标准样品及典型样品色谱图参见附录A.7 结果计算与表示7.1 结果计算烟叶子基中茄尼酶的含量按式(1)进行计算，烟叶提取物中茄尼酶的含量按式(2)进行计算zc xvxf 烟叶:X = .,. i ,. J X 10-3 . ( 1 ) mX (l -w) cxvxf 烟叶
14、提取物:x=一一一一一X10 . . . . . . . . . . ( 2 ) m 式中zX一一试样干基中茄尼酶的含量(以质量分数计)，单位为毫克每克(mg/g); c一二由标准工作曲线得出的茄尼醇浓度，单位为徽克每毫升(g/mL); V一一试样最终定容体砚，单位为毫升(mL);f二一试样稀释倍数，测定烟叶、烟膏f=25;测定提取液f=l;m一试样质量，单位为克(g);W 烟叶试样水分的质量分数。7.2 结果囊示测定结果以平行测定的算术平均值表示，计算结果保留两位有效数字。两次平行测定结果的相对平均偏差不应超过5%。8 精密度和国收率本方法的精密度和回收率试验结果参见附录B.9 幢验报告检验
15、报告应包括以下内容t一一识别被测试样需要的所有信息z一一依据本标准方法(本标准编号); 一一茄尼酶的测定结果z一实验日期p测定人员.此外，还需说明使用的方法，还应包括本标准未规定的或选择性的条件，以及可能影响结果的其他条件.测试报告应包括试样的唯一性资料.4 GB/T 31758-2015 附录(资料性附录色罐圄示倒A 标准溶液及典型样品色谱图示例分别见图A.l-图A.4.0.18 0.16 0.14 0.12 :J 0.10 0.08 adv?温州镇。.060.04 0.02 0.00 10.00 9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 mm 4.00 3.00 2.00 1.00
16、 标准溶溃色谱圄固A.1O. 18 。.160.14 由9.?撞腿根O. 12 0.10 。.083 10:00 0.06 0.02 O. 0.04 烟时试样色谱圄圄A.25 GB/T 31758-2015 0.18 O. 16 0.14 O. 12 O. 10 0.08 性时吧?键时吨桶0.06 0.04 0.02 10.00 9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 mtn 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 姻膏试梓色谐圄圄A.30.18 O. 16 0.02 0.14 2 0.08 0.06 0.04 0.12 0.10 10.00 9.00 8.00 7.00
17、6.00 5.00 mtn 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 提取攘试样色谱圄圄A.46 GB/T 31758-2015 附录B资料性附录精密度和回收率试验研究结果B.1 本方法的精密度试验研究结果见表B.l.表B.1本方法的精密度试验研究结果(n=6) % 样品名称烟叶烟膏提取液检测参数游离茄尼蹲总茄尼蹲曾昏离茄尼蹲总茄尼蹲游离茄尼蹲总茄尼蹲a 日内相对标准偏差1.9 3.3 1.2 1.7 1.5 2.0 日间相对标准偏差2.2 3.5 1.6 2.2 2.2 2.5 B.2 本方法的回收率试验研究结果见表B.2.表B.2本方法的回收率试验研究结果取样量茄尼蹲样品中茄加入茄
18、实测茄回收率平均检测参数样品名称含量尼蹲含量尼自事量尼酶量回收率g mgfg % % mg mg 盯19婚姻福建汩的1.0225 7.8 8.0 10 18 95.1 自肋姻湖北C3的1.030 7 19 19 20 39 99.1 香料烟(云南81)1.220 4 1.6 2.0 2.0 3.9 96.5 游离茄尼障98.0 某混合型婚姻下脚料1.0678 9.8 10 10 20 98.2 烟膏0.149 6 1.9X 102 28 30 58 99.7 提取液1.052 2 0.53 0.56 1.0 1.6 98.9 烤烟福建汩的1.0225 9.8 10 10 20 95.6 自肋烟
19、(湖北C3F)1.030 7 20 21 20 40 95.9 香料烟(云南81)1.220 4 2.8 3.4 4.0 7.3 96.4 总茄厄E事96.9 某混合型婚姻下脚料1.0678 12 13 10 22 95.0 烟膏0.149 6 2.5X 102 38 40 77 99.6 提取液1.052 2 0.55 0.58 1.0 1.6 97.9 EON-mhFmH筒。华人民共和国家标准烟叶和烟叶提取物中茄尼酶的测定高效渡相色谱法GB/T 31758-2015 国中 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平墨西街甲2号。00029)北京市西城区三里罚北街16号(10004日网址总编室1(010)68533533发行中心:(010)51780238读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张0.75字数17千字2015年7月第一次印刷开本880X12301/16 2015年7月第一版铸韬号:155066. 1-51218定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话1(010)6851010731758-2015
