1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 31790-2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检疲鉴定方法Detection and identification of Potato s pindle tuber viroid 2015-07-03发布2015-11-27实施fe酬献给加州呐伺币命活础。街36i.J;王三-t中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局峪非中国国家标准化管理委员会在何中华人民共和国国家标准马铃薯纺锤块茎类病毒检瘟鉴定方法GB/T 31790-2015 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平墨西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(10
2、004日网址总编室:(010)68533533发行中心:(010)51780238读者服务部沃010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X1230 1/16 印张1字数26千字2015年8月第一版2015年8月第一次印刷 书号:155066. 1-49510定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107G/T 31790-2015 前-E 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能渺及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(
3、SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位z中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、黑龙江省农业科学院植物脱毒苗术研究所、中华人民共和国甘肃出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人t张永江、刘洪义、刘忠梅、辛苦言、陈慧、陈红运、马洁、吕典秋、沈建国、廖富荣、文朝慧、张成标、吴兴海.I G/T 31790-2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了基于寄主植物症状及基因组特征的马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法。本标准适用于可能携带有马铃薯纺锤块茎类病
4、毒的马铃薯组织材料的检疫鉴定。2 规菇性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18133 马铃薯种薯SN/T 2481 进境马铃薯种薯检疫操作规程3 仪器设备、用具及试割3. 1 仪器设备电子分析天平(0.001g)、垂直电泳槽、小型离心机、台式冷冻离心机、普通PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳系统、pH计、凝肢成像系统、4C冰箱、超净工作台、-80C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微波炉等。3.2 用具
5、可调移液器(2.5L、10L、20L、100L、1000L)、吸头、离心管(0.2mL、0.5mL、1.5mL)及研钵等。3.3 试剂除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂。R-PAGE试剂见附录B;RT-PCR试剂见附录C;实时荧光RT-PCR试剂见附录D.4 栓副方法4.1 样晶制备4. 1. 1 脱毒苗制样E对脱毒苗要逐株制样，在无菌条件下，从脱毒苗上剪下长2cm的茎段，放于小研钵中，用于提取核酸并进行后续检测F把取样的脱毒苗放回试管中，封好管口并编号，以便根据检测结果决定取舍。4. 1.2 种薯制样E在隔离种植前对种薯块茎进行症状检查，对有明显症状的薯块，直接取症状部位0.
6、2g 0.5 g用于核酸提取并进行后续检测，对于无明显症状的薯块进行隔离种植。4.1.3 隔离种植植株制样E种薯隔离种植按照SN/T2481的规定执行，生长温度应至少高于18C (更GB/T 31790-2015 适宜的温度是高于20C)和至少16h的光周期。在生长期间进行严格的症状检查，症状参见附录A。在花期或接近花期时，对可疑症状的植株，每株采取植株顶部完全展开的叶片0.2g0.5 g单独制样，用于核酸提取并进行后续检测p如果没有发现可疑症状，可5株混合采样用于核酸提取并进行后续检测。4.1.4 田间植株制样z对田间生长的植株作整体观察后，对症状可疑的植株，每株采集症状叶片0.2g-0.5
7、 g单独制样，进行核酸提取并进行后续检测z如果没有发现可疑症状，则按GB/T18133的要求每5株混合采样，进行核酸提取并进行后续检测。4.2 R啕PAGE副定R-PAGE测定见附录B。4.3 RT-PCR检测RT-PCR检测见附录C.4.4 实时黄先RT-PCR检测实时荧光RT-PCR检测见附录DD5 结果判定显症马铃薯样晶经4.2、4.3及4.4中的一种方法检测为阳性，则判定样品携带PSTVdl无症马铃薯样品经单一方法检测为阳险，需不同原理的检测方法确认一次，两次结果均为阳性，则判定样品携带PSTVd. 6 样晶保存与结果记录6.1 样晶保存结果判定为阳性的样品应妥善保存，并作好登记和标记
8、，以备复核用。保存期满后，需经灭活处理。6.2 结果记录完整的试验记录应包括z样品的来酒、种类、时间，试验栓测时间、地点、方法和结果，并有试验人员的签字z种薯隔离种植的显症植株应有显症照片;R-PAGE测定应有银染色结果图片，RT-PCR检测应有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR检测应有扩增曲线结果图片。2 GB/T 3 t 790-20 t 5 附录A资料性附录马铃薯纺锤块莲英病毒相关资料A. 1 背景资料A.l.1 马铃薯纺锤块茎类病毒基本信息学名:Potatosindle tuber viroid 0 缩写:PSTVd。异名:Potato pindle tuber virus、Potat
9、ogothic virus和Tomatobunchy top virus. 分类地位E马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae)，马铃薯纺锤块茎类病毒属(Posiviroid)。传播途径z远距离传播主要通过国际间或地区间种薯贸易z田间可通过机械接触及被感染的农机具等进行传播。A.l.2 方法原理根据PSTVd在寄主植物上的症状进行初步判定F根据其RNA自然状态和变性后的不同结构分子在聚丙烯酿胶凝胶电泳中迁移率的差异进行往复双向聚丙烯酷腊凝胶电泳(return-polyacrylamidegel electrophoresis, R-PAGE)检测，根据其基因组特征进行常规RT-PCR
10、或实时荧光RT-PCR检测，通过电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定。A.2 寄烹范围自然寄主有马铃薯(Solanumt础W功刷m)、番茄(Lycopersiciesculen阳m)、鳝梨(Perseaamericana)、人参果(Solanummuricatum)、曼陀罗(Daturastramonium)、素馨叶白英(Solanumjasminoides)、蓝花茄(S.rantonnetii)、果酱木(Stre乡tosolenjamesonii)和灯笼果(Physalisperuviana)。人工接种寄主有31属94种。鉴别寄主z常用的鉴别寄主有鲁特格尔斯番茄(Lycoersicone
11、sculentum cv. Rutgers)和在若(Scoolia sinensis)。A.3 地理分布北美洲z美国(堪萨斯、缅因、马里兰、密西根、纽约、威斯康星)、加拿大(阿尔伯特、哥伦比亚、新布伦斯维克、安大略、爱德华岛、魁北克)。欧洲z捷克、法国、德国、匈牙利、荷兰、波兰、斯洛伐克、瑞士、土耳其、英国、苏格兰、前苏联。南美洲z阿根廷、乌拉圭、巴西、秘鲁、古巴。非洲z南非、尼日利亚。亚洲E阿富汗、印度、日本、中国(河北、黑龙江、江苏)。大洋洲z澳大利亚新南威尔士、维多利亚)。3 GB/T 31790-2015 A.4 传播途径被感染的繁殖材料如实生种子及种薯等是远距离传播的主要途径F田间可
12、通过机械接触、汁液接种、农民的衣物、被感染的农机具及切取块茎的切刀等进行传播。咀嚼式昆虫的传播已有报道，但还未定论.当PSTVd和马铃薯卷叶病毒(Potatoleafroll virus. PLRV)混合侵染时.PSTVd可通过蜻虫传播。A.5 在就特征PSTVd侵染马铃薯引起的症状表现与其株系、栽培品种品系及环境条件有关。PSTVd可以引起植株矮化，茎轩直立僵硬，叶片叶柄与主茎的夹角变小，呈半闭半合状和扭曲，叶片叶柄常呈锐角形态向上竖起。有的全株失去润浑的绿色，有的从上方观察叶子是晴绿色和皱缩的F有的顶部叶片变小、卷曲、耸立，有的感病植株不表现症状见图A.l)。块茎变小，畸形，有的顶端变尖，
13、圆形的块茎变长，有的表面开裂，有的芽眼突出，典型的块茎症状为纺锤形或哑铃形见图A.2)。A.6 基因组特征PSTVd是一种含356个-351个核昔酸、具有侵染性、无外壳蛋白、高度碱基配对的棒状共价闭合环状单链小的RNA分子。PSTVd的RNA变性后转变为开环状分子，这种开环状的RNA分子在聚丙烯酷腊凝胶电泳中迁移率比相同相对分子质量的线状分子要慢得多。圈A.1受马铃薯纺锤块墓类病毒僵染的马铃薯撞栋症棋4 GB/T 31790-2015 注z从左肉有三个块茎是感染PSTVd的症状，表现为纺锺形，最右边的个块茎是健康对照.圄A.2萤马铃薯纺锤块茎棠病毒侵染的马铃薯块茎症状注2阁A.l和图A.2引自
14、EPPOStandards PM 7/33.Potato spindle tuber pospiviroid. 5 GB/T 31790-2015 附录B(规范性附录往复双向嚣丙烯酷朦凝股电泳法(坠PAGE)B.1 试剂与材料以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水。B.1.1 0.5 mol/L Z二键四ZI量二铀(Na2EDTA.2H20)溶罐(pH8.0) 称取乙二镀四乙酸二铀(NaaEDTA.2H20)186.1 g.榕于700mL水中，用氢氧化销(NaOH)调pH至8.0.加水定容至1000mL. B.1.2 水饱和酣(pH4.0) B.1.
15、3 焦碳酶二Z醋(DEPC)处理的水在100mL水中，加入焦碳酸二乙醋(DEPC)50L.室温过夜.121.C高压灭菌20min. B.1.4 3 mol/L Z瞌铀(4H3Na02.3日20)溶液(pH5.2) 称取乙酸铺(CaH3Na02 3HaO)24.6 g.加水80mL溶解，用冰乙酸(CaH4O2)调pH至5.2.定容至100mL。B. 1.5 1 mOl/L三经基甲基氨基甲皖盐酸(Tm-HCl)溶灌(pH8.0) 称取三短基甲基氨基甲烧(Tris)121.1g.溶解于800mL水中，用被盐酸(HCl)调pH至8.0.加水定容至1000 mL.121 c高压灭菌20min. B. 1
16、.6 RNA提取缓冲撞称取三短基甲基氨基甲烧(Tris)12.12g.氯化铀(NaCD5.88g.乙二股四乙酿二铀(NaaEDTA.2H20)3.75 g.加水至900mL，溶解后用浓盐酸(HCD调pH至9_9.5.加水定容至1000 mL.121 .C高压灭菌20min. B. 1.7 5x三握基甲基氨基甲嫂酣睡(TBE)电泳锺冲渡称取兰是基甲基氨基甲镜(Tris)27g.酣睡(H3B03)13.75g.量取0.5mol/L乙二镜四乙酸二铀榕液(Na2EDTA.2HaO.pH 8.0)10 mL.加灭菌双蒸水400mL溶解，定容至500mL。B.1.8 30%胶贮攘称取丙烯眈胶(C3HsNO
17、)29g，N.N-亚甲基双丙烯酷胶(C，HJoN202)1g.加水定容至100mL.过撞除菌，4.C储存。B.1.9 10%过确踵镀(N&hOaJ溶灌现用现配称取0.1g过硫酸镀(NH4)aS20J.加水定容至1mL。6 GB/T 31790-2015 B.1.10 四甲基乙二膜(TEME)B. 1. 11 5%黯丙烯酷眼(PAM)凝肢量取5XTBE电泳缓冲被9mL，30%肢贮被7.6mL，四甲基乙二胶(TEMED)44L，10%过硫酸镀(NH4)2S20SJ榕液200L，加水至45mL. B. 1. 12 固定簸，量取无水乙蹲(CzHsOH)30mL及冰乙酸(CzH.02)3mL，加水定容至
18、300mL。B. 1. 13 染色擅称取硝酸银(AgNOa)O.6g，加水搭解，定容至300mL. B. 1. 14 显色擅(现配现用在300mL水中，加入氢氧化铀(NaOH)3g及甲醒(HCHO)1mL，混合均匀。B. 1. 15 纬止蔬称取碳酸铀(Na2C03)3.7g.加水溶解，定容至300mLo 注2电泳中周到的丙烯酷胶CC，比NO)是神经毒剂，避免接触皮肤，操作时要带手套.B.2 实验步骤B.2.1 样晶RNA的提取分别称取阴性(健康对照、阳性(染病)对照及待检样品0.5g，放于灭菌冷冻研钵中，加人1mL RNA提取缓冲液、1mL水饱和酣和1mL三氯甲烧，充分研磨后倒入1.5mL离心
19、管中，于4C下13000 r/min离心15min，用移液器小心将上层水相移入另一离心管中e再加入3倍体棋元水冷乙蹲及1/10体积的3mol/L乙酿铀搭液后混匀，一20C沉淀1.5h以上。4C下13000r/min离心15min , 弃掉上清液，用1mL 70%乙醇清洗沉淀，然后离心，再用吸头彻底吸弃遗留在营中的上清液，在自然条件下干燥至核酸沉淀变成白色或透明快态，再将核酸沉淀榕于30LDEPC处理水中。一20C贮存备用.注z可采用等效的RNA提取试剂盒完成RNA的提取。B.2.2 电泳B.2.2.1 正向电豫电泳用5%聚丙烯酿胶凝肢，1XTris-跚酸(TBE)电泳缓冲液，电泳方向从负极到正
20、极，电流量为每厘米凝胶5mA。点样量为6L10L。当二甲苯腊示踪染料迁移到凝肢板底部时停止电泳。B.2.2.2 反向电泳将正向电泳缓冲液倒出，然后把电泳槽放到70C 80 c的烘箱中预加热，样品变性30min.同时将倒出的电旅缓冲掖在微波炉中加热到80C。倒入电泳槽中，变换电极进行反向电泳。当二甲苯腊示踪染料迁移到凝胶板顶部时，停止电泳，进行凝胶染色。7 GB/T 31790-2015 B.2.3 染色B.2.3.1 固定将电泳胶片放在盛有300mL核酸固定液的容器中，轻缓振荡10min后，倒掉固定液。B.2.3.2 染色向容器中加入300mL染色液，轻缓振荡15min后，倒出染色液。用蒸馆水
21、冲洗胶板，反复冲洗4次。B.2.3.3 显色加人300mL显色液，轻缓振荡，直至显现清晰的核酸带，然后用自来水冲洗，反复冲洗4次。B.2.3.4 鳝止将胶板放入300mL终止液中终止反应。B.3 结果判定在凝胶板下方四分之一处的核酸带为类病毒核酸带，与上部寄主核酸带之间有一定距离，二者可明显分开。以电泳时载人的阴阳性样晶作为对照，进行结果判定z满足前面条件，并出现与阳性对照一致的条带则判定为阳性F没有相应条带出现为阴性。8 GB/T 31790-2015 C.1 试剂C. 1. 1 RNA提取缓冲蘸或合格的试剂盒C.l.2 50xTAE电豫罐冲撞(pH8.0) 附录C(规范性附录RT-PCR检
22、测方法三是甲基氨基甲烧(Tri5)242 g、冰乙醺(CzH4 Oz ) 57. 1 mL、乙二肢四乙酿二锅(NazEDTA.2HzO)37.2 g，蒸情水定容至1000mL，用时稀择至1XTAE.C.2 实验步骤C.2.1 植物材料总核酸提取可采用附录B或附录D提取植物材料总核酸法，也可采用等效的试剂盒提取总RNA.C.2.2 iJl物合成上游引物:5-ATCCCC GGG GAA ACC TGG AGC GAA C-3 下游引物:5-CCCTGA AGC GCT CCT CCG AG-3 C.2.3 cDNA合成在样品管中加入5L下游引物(4mol/L)及5LRNA样品，混匀，瞬时离心55
23、; 90 C温浴5 min，完全变性RNA和引物，4c瞬时离心5s.把样品管放在冰上或-20C预玲的冰盒上，在变性过程中，准备RT主要反应液(DEPC水1.9L，反转录酶E缓冲液4L，O.lM DTT 2L， RNA酶抑制剂。.5L，25mmol/L dNTP5 0.8L，200 UjL反转录酶0.8L，共10L)，混匀，瞬时离心，冰上预冷，备用。在变性后的样品管中加入10LRT主要反应液，50C温浴1b , 95 C温浴3 min，破坏E型逆转录酶活性，瞬时离心。PCR或一20C保存备用。C.2.4 PCR扩增每个cDNA样品一式两份，用已知健康、感病的样晶的cDNA和DEPC水分别做阴性对
24、照、阳性对照和空白对照。PCR反应体系见表C.1。反应程序:94 c 9 min 15 5;94 C 455,62 C 455, 72 C 605，40个循环;72 C 10 min. 组分DEPC水表C.1PCR反应体系AmpliTaq缓冲液无MgCI2)体税/L9.57 2.2 9 GB/T 31790一2015表C.1(续组分体飘/LMgClz (25 mmol/L) 1.32 dNTPs(1 mmol/L) 4.4 上淤引物(20mol/L)1.1 下游引物(20mol/L)1.1 AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5 U/L) 0.11 cDNA模板2.2
25、总体积22 一C.2.5 琼脂糖摄肢电珠制备1%的琼脂糖凝胶，按比例混匀电抹上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNAMarker作为分子量标记，进行电泳分析。电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA条带，并拍摄记录。C.3 结果判定C.3.1 阳性对照在359bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性.C.3.2 阳性对照在359bp左右处有扩增片段，阴性对照、空白对照及待测样品无特异性扩增，可判定结果为阴性。10 GB/T 31790-2015 附录D规范性附录实时黄先RT-PCR栓割方法O. 1 试剂0.
26、1.1 十六锦基三甲基澳化膜(CTAB)提取缓冲溃十六烧基三甲基漠化腊(CTAB)20 g,100 mmol/L三短基甲基氨基甲烧-盐酸(Tris-HCD(pH 8.0) , 20 mmol/L乙二镀四乙酸二销(NazEDTA.2H20)，氧化铺(NaCD81.8g，加蒸馆水定容至1L, 121 C 高压灭菌20min，室温储存。0.1.2 1%十二烧基萌酸铀(SOS)三强基甲基氨基甲媲(Tris)乙二膜四乙酸二铀(Na2EOTA 2H20) (SDS-TE)罐冲撞10 mmol/L三短基甲基氨基甲烧-盐酸(Tris-HCD(pH 8.0) , 1 mmol/L乙二镀四乙酸二铀(Na2EDTA
27、. 2H20) ，1%十二烧基磺酸铀(SDS)。0.2 试验步骤0.2.1 核酸提取称取100mg.200 mg样品组织于研钵中，液氮研磨后加1mL.2 mL CTAB提取缓冲液现用现加上新的1%NaZS03 ,2% PVP-40)。将汁液移到1.5mL离心管中，65C温播30min;室温13000r/min离心5min.取700L上清液，加700L三氯甲烧=乙酸异戊醋(24: 1)，颠倒混匀;13 000 r/ min离心5 min.取500L上清液，加500L兰氯甲皖=乙酸异戊醋(24:日，颠倒混匀;13 000 r/min离心5min. 取上清掖，加0.5倍体积的5mol/L NaCl和
28、等体积预冷的异同酶，混匀，一20C过夜，13000 r/min离心10min，沉淀核酸。用200L1%SDSTE缓冲液悬津沉淀，如100L5 mol/L NaCl和300L预冷异丙酶，混匀，一20c放置30min;13 000 r/min离心10min，用400L乙醇洗沉淀，离心4min;留沉淀，干燥，用100LDEPC水重悬沉淀，-20.C保存。0.2.2 I物摞针合成PSTVd-231F:5-GCC CCC TTT GCG CTG T-3 PSTVd-296R:5-AAG CGG TTC TCG GGA GCT T习PSTVd-251T:5-FAM-CAG TTG TTT CCA CCG
29、GGT AGTAGC CGA-TAMRA-3 0.2.3 实时荧光RT-PCR反应取两个离心管，分别配制第一阶段主要混合被(7.5mol/LPSTV-296R 1.0L，DEPC水3.0L)和第二阶段主要混合液(见表D.1).每个反应一式两份，一个RNA阳性对照，一个空白对照，一个无感染RNA阴性对照。按上面规定的顺序和数量拥试剂，冰潜.准备0.2mL PCR管.向每个管里加1L总RNA或对照材料，加4L第一阶段的反应液，把管放到PCR仪上。反应程序:95c 3 min , 1个循环F离心管4C冷却5min.10 min;同时向荧光PCR管加20L第二阶段的反应液z变性完成由FON|。hFmH筒。GB/T 31790-2015 后，吸取第一个反应阶段的混合液加到相应的第二阶段混合液管内，确保这个混合液分散到每个管的底部F将荧光PCR管放到实时荧光PCR仪中。反应程序:48c 30 min;95 C , 10 min;95 C 15 9 ,60 C 1 min，40个循环。实时荧光PCR反应体系组分加样量/L10 X PE TaqGold缓冲液A2.5 MgCla (25 mmol/L) 5.5 dNTPs(6.25 mmol/L) 2.0 PSTV-231F(7.5 mmol/L) 1. 0 PSTV-251T 2015
