1、. ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 31791-2015 棉花曲叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Cotton leaf curl virus 2015-07-03发布2015-11-27实施/?e 中华人民共和国国家质量监督检验检亵总局也tz中止中国国家标准化管理委员会。咽GB/T 31791 2015 前吉同本标准按照GBjT1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SACjTC271)提出并归口。本
2、标准起草单位z中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国探圳出人境检验检疫局、中华人民共和国茂名出人境检验检疫局。本标准主要起草人z张立、张永江、冯黎霞、李曼、张祥林、周雪平、郑耘、马洁、李海林、辛吉吉、朱水芳、李明福。I 棉花曲叶病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了棉花曲叶病毒的免疫学及分子生物学检疫鉴定等方法。本标准适用于可能携带棉花曲叶病毒的植物组织的检疫鉴定。2 仪器设备、用具和试剂2.1 仪器设备GB/T 31791-2015 电子分析天平(0.001g)、小型离心机、台
3、式冷冻离心机、恒温水浴锅、酶标仪、普通PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4C冰箱、超净工作台、-80c超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微波炉等。2.2 用具可调移液器(2.5L、10L、20L、100L、1000L)、吸头、离心管、Eppendorf管(0.2mL、0.5 mL、1.5mL)和研钵等。2.3 试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。DAS-ELISA、常规PCR及实时荧光PCR检测试剂分别见附录B、附录C及附录D.3 栓瘦鉴定方法3.1 DAS-ELISA栓测DAS-ELISA检测见附录B.3.2 常规PCR检测常规PCR检
4、测见附录C.3.3 实时荧光PCR撞测实时荧光PCR检测见附录D。4 结果判断3.1、3.2及3.3中两种不同原理的检测方法的结果为阳性，即可判定样品为CLCuV阳性。一般是DAS-ELISA检测为阳性后，常规PCR或实时荧光PCR检测结果为阳性即可判断样品为CLCuV阳性。1 GB/T 31791-2015 5 样晶保存与记录结果5.1 样晶保存结果判定为阳性的样品应妥善保存，并做好登记和标记，以备复核用。保存期满后，需经灭活处理。5.2 结果记录完整的实验记录要包括z样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，井有实验人员的签字，DAS-ELISA检测需有酶联反应原始数据，PC
5、R检测需有电泳结果图片，实时荧光PCR检测需有扩增曲线结果图片。2 . GB/T 31791-2015 A.l 背景资料A. 1. 1 棉花曲叶病毒基本信息中文名z棉花曲叶病毒。学名:Cotton leaf curl virus. 缩写:CLCuV。附录A(资料性附录棉花曲叶病毒背景资料分类地位E双生病毒科(Geminiviridae)莱豆金色花叶病毒属(Begomovirus)。传播途径E烟精虱(Bemisiatabaci)传播及苗木嫁接传播。A. 1.2 方法原理根据棉花曲叶病毒与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)检测g根据该病毒DNA保守区的特异
6、性进行常规PCR或实时荧光PCR检测，通过电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定。A.2 寄主范围该病毒可侵染的寄主有E棉花(Gossyiumhirsutum)、烟草(Nicotiana tabacum)、秋要(Hibiscusesculentus)、番茄(Lycopersiconesculentum)、扶桑(Hibiscusrosasinensis)、芮麻(Abutilon theo phrasti )、芝麻(Sesamumindicum)、矮牵牛(Petuniahybrida)、曼陀罗(Daturastramonium)等。A.3 分布该病毒现主要分布在巴基斯坦、印度、苏丹、埃及、尼日利
7、亚、马拉维和南非.A.4 病富症状棉花植株受侵染后，早期表现新叶卷曲、叶脉膨大，后期在叶背面的主脉上形成耳突，植株矮化，结实率下降或不结实。A.5 粒体形奋棉花曲叶病毒具有典型的双联体颗粒形态，大小为18nmX 30 nm20 nmX 30 nm. A.6 基因组特征该病毒的基因组含有2个大小相近的环状ssDNA组分，大小为2.5kb3.0 kb。3 GB/T 31791-2015 附录B规范性附录双抗体夹心酶联免在眼睛测定(DAS-EL囚A)B.1 试剂辑树B. 1. 1 酶联握的要求使用质量有保证厂商生产的酶联板。B.1.2 包被抗体特异性的棉花曲叶病毒抗体.B.1.3 酶标抗体碱性磷酸醋
8、酶标记的棉花曲叶病毒抗体。B. 1.4 底物对硝基苯磷酸二铀(pNPP)。B.1.5 10 X PBST罐坤攘(pH7.的氧化销(NaCD80g、磷酸二氢饵(KHaPO.)2g、磷酸氢二铀(NazHPO.)11.5g、氧化御(KCD2g、吐温-20(Tween-20)5mL.用盐酸(HCl)调pH至7.4.并定容至1000mL.4 C条件下贮存.B.1.6 样晶抽提罐坤灌(pH7.4) 亚硫踵锅(Na2S03)l.3g、聚乙烯基毗咯烧酣(MW24 000-40 OOO.PVP)ZO g、叠氮化铺(NaN3)0.2 g、吐温-20(Tween-20)20mL，榕于800mL的lXPBST中，用盐
9、酸(HCD调pH至7.4，如lXPBST定容至1000mL.4 C条件下贮存。B. 1.7 包擅抗体摄冲谛(pH9.6) 碳酸铀(Na2COs)1. 59 g、碳酿氢铀CNaHCOs)2.93 g、叠氧化铺(NaN3)O. 2 g，用盐酸(HCD调pH至9.6，加水定容至1000mL, 4 C条件下贮存。B.1.8 洗海缓冲撞将lXPBST缓冲液用盐酸(HCD调pH至7.4，4C条件下贮存。B.1.9 酶标抗体锺冲撞(pH7.4) lXPBST缓冲液800mL、牛血清白蛋白(BSA)2g、聚乙烯基毗咯烧酣(MW24 000.-40 000 , PVP)20 g、叠氧化铀(NaN3)0.2g.用
10、lXPBST定容至1000 mL, 4 C条件下贮存.B. 1. 10 鹿物(pNPP)缓冲撞(pH9.8) 二乙酶腊(C.Hl1NOz)97mL、叠氧化铺(NaN3)0.2g，用盐酸(HCD调pH至9.8，用蒸铺水定容至4 . 1 000 mL, 4 C条件下贮存。B. 1. 11 底物(pNPP)溶撞GB/T 31791-2015 将4-硝基酷磷酸铀盐(pNPP)100 mg溶解于pNPP底物缓蹄液100mL中，现配现用。B. 1. 12 反应鳝止罐氢氧化铀(NaOH)40g，用蒸馆水定容至1000mL. B.2 样品制备取待栓样品0.2g-1. 0 g.接1: 5(g/mL)如人样品提取
11、缓冲液，用研钵研磨样品，4000 g离心5 min后吸取上清液待用eB.3 操作步骤B.3.1 包镇抗体根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上，包括2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照孔和多个待检测样品孔，每个样品重复2次$每孔加人100L的包被抗体榕液，封口膜包好，37C孵育2 h-4 h(或4C冰箱过夜)。B.3.2 加样将酶联板孔中禧被控干，用PBST洗涤3次，每吹3min，然后在滤纸上扣干g将100L待测样品溶液加入到待检测孔中，对照孔中也各加人100L相应的对照。封口膜包好，37C孵育2h-3 h(或4C 冰箱过夜。B.3.3 加酶标抗体洗涤，步骤同B.3.2;用晦标抗体稀释
12、缓冲撞按照要求稀释酶标抗体，每孔加人100L靡标抗体潜辙，封口膜包好，37C膊青2h-4h。B.3.4 加底物洗涤，步骤同B.3.2;每孔加入1L底物榕液，室温孵育0.5h2 h。必要时每孔加入50L的终止掖终止反应。B.3.5 读鼓酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录。B.4 结果判定B.4.1 属量控制要求空白对照孔和阴性对照孔00405值2，同一样品的00405值应基本一致.5 GB/T 31791-2015 B.4.2 结果判定6 若满足不了B.4.1的质量要求，则不能进行结果判定。在满足了B.4.1的质量要求后，则按如下原则作出判定z一样品OD.05值/阴性对照OD制值明显大
13、于2.结果判定为阳性s一样品OD.05值/阴性对照OD值在阔值附近，判为可疑样晶，需重做一次或者用3.2或3.3方法进行验证s一一样品OD4Q5值/阴性对照OD削值明显小于2.判为阴性。. C.1 试剂C. 1. 1 提取缓冲撞A附录C规茹性附录常规PCR撞测GB/T 31791-2015 葡萄糖(C6H1206)60g、铜试剂(NaDIECA)23g、聚乙烯基毗咯烧酣(MW24 000-40 OOO.PVP) 20 g、琉基乙晖(H60S)0.8mL.禧解于1mL蒸锚水中，常温下贮存。C.1.2 提取罐冲撞B10 mmol/L Tris-HCl、20mmol/L乙二镀四乙酸二销(NaaEDT
14、A 2HaO)、0.5mmol/L氯化铀(NaCl)、1.5%十二烧基磺酸铀(SDS).pH 8.0. C. 1.3 50 X TAE电珠缓冲渡(pH8.0) 三垣甲基氨基甲烧(Ts)242 g、冰乙酸(CaHOa)57.1mL、乙二股四乙酸二铀(NaaEDTA.2H20)37.2 g.蒸馆水定容至1000 rnL.用时稀释至1XTAE. C.2 引物上游引物CL1/时-GTCGCAGGATTA TTCAIG川下游引物CL3a/R:5人GTTGCTAGCGTGAGTACAA-3 ; 用于扩增棉花曲叶病毒DNA-A组分保守区791bp大小的片段。C.3 核酸提取分别称取阴性健康对照、阳性染病对照
15、及待检样品的植物组织3)rng.加入100L提取缓冲液A.研磨后.1000g离心10rnin.沉淀加人200L提取缓冲液B.混匀后将离心管置于65C恒温水播中30rnin-60 rnin.加入200L三氯甲烧E异戊酶=乙醇(80: 4 : 1时，颠倒混匀，室温静置5rnin-10 rnin后，室温下5000g离心5rnin.上清液加人2倍体积的乙晖.-20 C放置1h.12 000 g离心10 rnin.沉淀用100L的0.1rnrnol/L Tris-HCl缓冲撞(pH8.0)榕解，贮存于一20C冰箱中备用。注g或者按照等效DNA提取试剂盒进行操作。C.4 PCR扩增0.2 mL PCR管中
16、加入10X PCR Buffer 2.5L. MgCla (25 mrnol/L) 2L. dNTPs (10 mmo1/L) 0.5L. CL1/F (10 rnrnol/L) O. 2L. CL3a/R (10 mmol/L) O. 2L. Taq酶(5U/L)0.3L.DNA 3.0L.ddH20补至25L.设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应条件:94C 3 min;94 c 1 min.60 C 1 min.72 C 1 min.36个循环;72 C 10 min. 7 GB/T 31791-2015 C.5 醺脂糖凝胶电泳检测制备1%的琼脂糖凝肢，按比例混勾电泳上样缓冲液和PCR
17、扩增产物，用DNAMarker作为分子量标记，进行电泳分析。电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA条带，并拍摄记录.C.6 结果判定如果阳性对照出现约791bp的条带，检测样品、阴性对照和空白对照未出现特异性条带，可判定样品为CLCuV阴性。如果阳性对照及检测样品出现约791bp的条带，阴性对照和空白对照未出现特异性条带，可判定样品为CLCuV阳性。8 D. 1 主要试剂DNA提取试剂见C.1oTaqMan PCR Mixtureo D.2 冒l物和摞针附录D(规范性附录)实时荧光PCR检测引物序列:CLCuV-F15-GCAGGAAAATACGAGAATCATA
18、CGG-3; CLCuV-R: 5 -TAATCTTCAACGTAGCATAAACAGGGT-3 , ; GB/T 31791-2015 探针序列:CLCuV-P:5人FAM-GTTAATGCTTTAT ATGGCTTGT ACTCACGC-T AMRA-3。D.3 核酸提取操作方法见C.3oD.4 实时荧光PCR反应反应体系:0.2mL离心管中加人TaqManPCR Mixture 10L. CLCuV-FOOmol!L) 0.4L. CLCuV-R(10mol!L)0.4L.CLCuV-P(10mol!L)0.4 ftL.DNA模板2L.补水至20L。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应
19、程序:95C 10 min;95 C 15 8.62 C 60 s.共40个循环。注:PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整，也可采用商业化试剂盒.D.5 结果判定在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值运30并出现典型扩增曲线的条件下z一一待测样品的Ct值注40时，判定CLCuV阴性z一一待测样品的Ct值35时，判定CLCuV阳性s一一待测样品的35Ct值40时，应重新进行测试;如果重新测试的Ct值注40时，判定CLCuV阴性z如果重新测试的Ct值40.且分离曲线明显时，则判定CLCuV阳性。9 的FON-mhFmH阁。华人民共和国家标准棉花曲叶病毒检擅鉴定方法GB/T 31791-2015 国中 中国标准出版社出版发行北京市鞠阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010)68533533发行中心:(010)51780238读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X1230 1/16 印张1字数18千字2015年8月第一版2015年8月第一次印刷椅18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107书号:155066. 1-49767定价
