1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 31803-2015 棉花皱叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Cotton leaf crumple virus 2015-07-03发布2015-11-27实施4沪剧室均气气民， 冉l，Ii:牛甲磊忌、-05三当:;运11中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 31803-2015 前古同本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能捞及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国植物检疫标准化
2、技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位z中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、浙江大学、浙江出人境检验检疫局。本标准主要起草人z张永江、雷荣、沈建国、周雪平、鲁洁、张明哲、李桂芬、朱水芳。I GB/T 31803-2015 棉花皱叶病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了棉花皱叶病毒的免疫学及分子生物学检疫鉴定等方法。本标准适用于可能携带棉花皱叶病毒的话体寄主植物叶片组织的检疫鉴定。2 仪器设备、用具和试剂2.1 仪器设备电子分析天平(0.001g) ，/J型离心机、台式冷冻离心机、恒温水播锅、酶标仪、普通PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶
3、成像系统、4C冰箱、超净工作台、-80C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微波炉等。2.2 用具可调移液器(2.5L、10L、20L、100L、1000L)、吸头、离心管、Eppendorf管(0.2mL、0.5 mL、1.5mL)和研钵等。2.3 试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。DAS-ELISA、常规PCR及实时荧光PCR捡测试剂分别见附录B、附录C及附录D.3 幢擅鉴定方法3.1 DAS-ELISA检测DAS-ELISA检测见附录B.3.2 常规PCR栓副常规PCR检测见附录C。3.3 实时荧光PCR检测实时荧光PCR检测见附录D。4 结果判断3.1、3
4、.2及3.3中两种不同原理的检测方法的结果为阳性，即可判定样品为CLCrV阳性。一般是DAS-ELISA检测为阳性后，常规PCR或实时荧光PCR检测结果为阳性即可判断样品为CLCrV阳性。GB/T 31803-2015 5 样晶保存与记录结果5.1 梓晶保存结果判定为阳性的样品应妥善保存，并做好登记和标记，以备复核用。保存期满后，需经灭活处理。5.2 结果记景完整的实验记录要包括z样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员的签字，OAS-ELISA检测需有酶联反应原始数据，PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光PCR检测需有扩增幽线结果图片.2 . A.1 背最资料A.
5、 1.1 棉花皱叶病毒基本信息中文名z棉花皱叶病毒。学名ICottonleaf crumle virus. 缩写，CLCrV.附录A(资料性附录棉花皱叶病毒背量资料分类地位z双生病毒科(Geminiviridae)莱豆金色花叶病毒属(Begomovirus) GB/T 31803-2015 传播途径z烟输虱(Bemisiatabaci)及苗木嫁接传播，机械接触、莞丝子(Cuscutasubinclusa)、种子及花粉不传播。A.1.2 方法原理根据棉花皱叶病毒与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附(DA5-ELISA)检测s根据该病毒DNA保守区的特异性进行常规PCR或实时荧
6、光PCR检测，通过电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定。A.2 寄主范围包括棉属(Gossypium)、商麻属(Ahutilon)、蜀葵属(Althaea)、水撞属(Hi仇isc、锦赛属(Malva)、栗豆树属(Castanospennum)、大豆属臼:ycine)、菜豆属(P，加seol及巢莱属(Vicia)的一些植物。A.3 分布该病毒主要分布在印度、墨西哥、美国、危地马拉及中东地区.A.4 病喜症就该病毒侵染棉花造成叶中脉组织增生、叶脉坏死或脉明，叶脉组织的叶肉部分偶尔出现红色小点，有时形成分散的泡斑z苞叶和花常畸形，叶柄弯曲，叶片向下卷曲并有明显的花叶。A.5 粒体形态病毒粒体双生
7、，无包膜，直径为17nm20 nm.二聚体长30nm32 nm. A.6 基因组特征该病毒具有Begomovirus病毒典型的基因组，含有2条大小均为2.5kb-3.0 kb的单链闭合环状DNA分子，即DNA-A和DNA-B，二者是棉花皱叶系统感染必需的。A和B共同区(commenrigon. CR)的序列同源性相对较低。3 GB/T 31803-2015 附录B规范性附录双抗体夹心酶联兔瘟吸附副定(DAS-ELISA)B.1 试剂辑材B.1.1 酶联板的要求使用质量有保证厂商生产的酶联板。B.1.2 包被抗体特异性的棉花皱叶病毒抗体。B.1.3 酶标抗体碱性磷酸醋酶标记的棉花皱叶病毒抗体。B
8、. 1.4 底物对硝基苯磷酸二铀(pNPP)B. 1.5 10 X PBST缓冲撞(pH7.的氧化铺(NaCD80g、磷酸二氢饵(KH2P04)2g、磷酸氢二铀(Na2HP04) 11.5 g、氧化饵(KCD2g、吐温-20(Tw配n-20)5mL，用盐酸(HCD调pH至7.4，并定容至1000 mL, 4 C条件下贮存。B. 1.6 梓晶抽提锺冲液(pH7.4) 亚硫酸销(NazSOs)1.3g、聚乙烯基唯咯烧嗣(MW24 000-40 000 , PVP)20 g、叠氮化铀(NaN3)0.2 g、吐温-20(Tween-20)20mL，榕于800mL的lXPBST中，用盐酸(HCD调pH至
9、7.4，加lXPBST定容至1000mL, 4 C条件下贮存。B. 1.7 包被抗体缓冲撞(pH9.6) 碳酸铀(Na2C03)1.59g、碳酸氢铀(NaHCOs)2.93g、叠氮化铀(NaN3)0.2g，用盐酸(HCD调pH至9.6，加水定容至1000 mL,4 C条件下贮存.B.1.8 洗海摄冲撞将lXPBST缓冲液用HCl调pH至7.4，4c条件下贮存。B.1.9 酶棕抗体锺冲撞(pH7.的lXPBST缓冲液800mL、牛血清白蛋白(BSA)2g、聚乙烯基毗咯烧圃(MW24 00040 000 , PVP)20 g、叠氮化铺(NaN3)0.2g，用lXPBST定容至1000mL, 4 C
10、条件下贮存，B. 1. 10 底物(pNPP)摄冲漳(pH9.8) 二乙薛腊(C4Hl1NOz)97mL、叠氧化铀(NaN3)0.2g，用盐酸(HCD调pH至9.8，用蒸锚水定容至4 GB/T 31803-2015 1 000 mL,4 c条件下贮存。B. 1. 11 底物(pNPP)溶撞将4-硝基酣磷酸铺盐(pNPP)100mg溶解于pNPP底物缓冲撞100mL中，现配现用B. 1. 12 反应鳝止遭氢氧化铀(NaOH)40g，用蒸铺水定容至1000mL. B.2 样晶制备取植物叶片组织0.2g1.0 g，按1: 5(g!mL)加人样品提取缓冲液，用研钵研磨样品.4000 g离心5min后吸
11、取上清液待用。B.3 操作步骤B.3.1 包被抗体根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上，包括2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照孔和多个待检测样品孔，每个样品重复2次p每孔加入100L的包被抗体椿液，封口膜包好.37C膊育2 h4 h(或4C冰箱过夜)。B.3.2 加样将酶联板孔中溶液控干，用PBST搅涤3次，每次3min.然后在滤纸上扣干F将100L待测样品禧液加人到待检测孔中，对照孔中也各加入100L相应的对照。封口膜包好.37C孵育2h3 h(或4 C冰箱过夜B.3.3 加酶标抗体洗涤，步骤阔B.3.2;用晦标抗体稀释锺冲撞按照要求稀稀酶标抗体，每孔加入100L酶标抗体溶液，封
12、口膜包好.37C孵育2h4h。B.3.4 拥底物洗涤，步骤同B.3.2;每孔加入100L底物溶液，室温孵育0.5h2 h。必要时每孔加入50L的终止液终止反应。B.3.5 读鼓酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录。B.4 结果判定B.4.1 盾量控制要求空白对照孔和阴性对照孔OD405值2;同一样品的00.值应基本一致，5 GB/T 31803-2015 B.4.2 结果判定6 若满足不了B.4.1的质量要求，则不能进行结果判定。在满足了B.4.1的质量要求后，则按如下原则作出判定z一一样品00.405值/阴性对照00.值明显大于2.结果判定为阳性，一一样品00.值/阴性对照00.峭值
13、在阔值附近，判为可疑样品，需重做一次或者用3.2或3.3方法进行验证p一一样品00.值/阴性对照00.405值明显小于2.判为阴性。C.1 试荆附录C(规范性附录常规PCR栓测C.1.1 十六蜿基三甲基羁化服(CTAB)DNA提取缓冲撞GB/T 31803-2015 十六皖基三甲基澳化胶(CTAB)4g，乙二蹄四乙酿二铀(NazEDTA 2H20 , 0.5 mol/L)8 mL，氯化铀(NaCD16.4g , 1 mol/L Tris-HCl 20 mL，琉基乙蹲(CzH6 05)4 mL，加蒸馆水定容至200mL，调pH至8.0，121C高压灭菌30min. C.1.2 十六烧基三甲基澳化
14、脏(CTAB)沉淀遭十六烧基三甲基漠化腹(CTAB)10 g，氯化铀CNaC1)4.1g，加水定容至100mL, 121 C高压灭菌30 min. C.1.3寓盐四罐冲撞乙二脑四乙酸二铀(NazEDTA.2H20.O.5 mol/L)0.02 mL，氧化铀(NaC1)5.85g , 1 mol/L Tris HC11 mL.加水定容至100mL，调pH至8.0，121C高压灭菌30mino C. 1.4 50 X TAE电漳缓冲班(pH8.0) 三起甲基氨基甲烧(Tris)242 g、冰乙酸(CzH. Oz ) 57. 1 mL、乙二脑四乙酸二铺(Na2EDTA.2HzO)37.2 g，燕锢水
15、定容至1000mL，用时稀择至lXTAE.C.2冒|物上游引物CLCrV-Bf:5t-CTCCTATCCTAATCTGGGCAAGACTG-3, 下游引物CLCrV-Br:5 -CGGTCCAAGAATGTATCAAGAGTAGTTGT-3 , ; 用于扩增棉花皱叶病毒DNA-B组分保守区域长度约为636bp的片段。C.3 核酸提取分别称取阴性(健康对照、阳性(染病对照及植物叶片组织0.5g于液氮中研磨，加入1.5mL 65 c预热的琉基乙薛/CTABDNA抽提液，掘匀后转人2mL离心管中，于65C温播1h，不时混匀s用等体棋的主氯甲烧/异戊蹲(24I 1)抽提，室温下10000 g离心10m
16、in;回收上清，加入等体现的CTAB沉淀液，颠倒混匀，于65C温浩1h;10 000 g离心5min，移出上清，用1.5mL高盐TE缓冲液重悬沉淀，加2倍体租无水乙酶抚淀核酸;12000g离心15min，70%乙酶洗涤;37 c干燥后禧于100L双蒸水中，-20C保存备用。注z或者按照等效DNA提取试剂盒进行操作.7 GB/T 31803-2015 C.4 PCR扩增0.2 mL PCR管中加入10XPCRbuffer(舍Mg2+)2L，dNTPs(10mmol/L)0.6L，CLCrV-Bf及CLCrV-Br(均为10mol/L)各0.5L，2U/LTaq酶1L，模板2L和ddHzO13.4
17、L.设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应条件;94C 5 min;94 C 30 s , 59 C 30 s ,72 C 30 s，30个循环，72C 8 min. C.5 琼脂髓凝肢电豫检测制备1%的琼脂糖凝肢，按比例混匀电泳上样缓冲破和PCR扩增产物，用DNAMarker作为分子量标记，进行电泳分析.电泳结束后在凝肢成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA条带，并拍摄记录.C.6 结果判定如果阳性对照出现约636bp的条带，检测样品、阴性对照和空白对照未出现特异性条带，可判定样品为CLCrV阴性。如果阳性对照及检测样品出现约636bp的条带，阴性对照和空白对照未出现特异性条带
18、，可判定样品为CLCrV阳性。8 D.1 主要试荆DNA提取试剂见C.1.TaqMan PCR Mixture. D.2 冒l物和摞针附录D(规范性附录实时荧光PCR幢测上游引物CLCrVFl-579:5-ACAGCCACTGAATGTGAAAAGAGAA-3; 下游引物CLCrVRl-72515人GTTCAGTCTTGCCCAGATTAGGA T A-3 I GB/T 31803-2015 探针CLCrVProbe: 5 -F AM-GGAA TTT ACAATGGCCCACAACACAG-T AMRA-3。D.3 核酸提取操作方法见C.3.D.4 实时荧光PCR反应反应体系:0.2mL离心
19、管中加入TaqManPCR Mixture 10L， CLCrV-Fl-579 (10mol/L) 0.4L，CLCrV-Rl-725(lOmol/L)0.4L，CLCrV-Probe(lOmol/L)0.4L，DNA模板2L，补水至20L.设置阳性对照、阴性对照及空白对照.反应程序:95C 10min;95 C 15 s.62 C 60 s，共40个循环。注IPCR反应体系中各种试剂的最可根据具体情况进行适当调整，也可采用等效试剂盒.D.5 结果判定在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值30并出现典型扩增曲线的条件下z一一待测样品的Ct值注40时，判定CLCrV阴性z-一一
20、待测样品的Ct值35时，判定CLCrV阳性s一一待测样品的35Ct值40时，应重新进行翻试z如果重新测试的Ct值注40时，判定CLCrV阴性s如果重新测试的Ct值40，且分离曲线明显时，则判定CLCrV阳性。9 巴ON|例。FmH阁。华人民共和国家标准棉花皱叶病毒栓瘦鉴定方法GB/T 31803 2015 国中 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平墨西街甲2号(100029)北京市西城区三星河北街16号(100045)网址总编室:(010)68533533发行中心:(010)51780238读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X 1230 1/16 印张1字数18千字2015年8月第一版2015年8月第一次印刷* 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107H号:155066. 1-49765定价
