1、道菌ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 31805-2015 E豆重花日十病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Cowpea severe mosaic virus 2015-11-27实施2015-07同03发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检窥总局中国国家标准化管理委员会飞，jr呐仙J俨、日GB/T 31805-2015 前-嗣同本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能静及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271
2、)提出并归口。本标准起草单位z中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标准主要起草人z陈青、李彬、方志鹏、黄峰、廖富荣、陈红运、林石明。I GB/T 31805-2015 虹豆重花叶病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了虹豆重花叶病毒检疫鉴定的血清学、生物学和分子检测方法。本标准适用于可能携带有E豆重花叶病毒的植物繁殖材料(种子、植株)和产品的检疫鉴定。2 仪器设备和主要试剂2.1 仪器设备PCR仪、定量PCR仪、灭菌锅、制冰机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、电泳仪、凝胶成像系统、微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平感量:0.001g)、水平电泳槽、高速冷冻
3、台式离心机、水浴槽、pH计、移液器(1000L、200L、20L、2L)、96孔酶标板、研钵等z防虫温室。2.2 主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCR缓冲液、dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、DNA聚合晦、引物和探针、琼脂，酶联检测试剂见附录B。3 栓测样晶的制备3.1 种子挑取畸形种子播于灭菌土中，待长出3片-4片叶后，将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(10株为1组并编号。采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子检测。3.2 植株有症状如叶片畸形、花叶、斑驳等的植株编号单独检测。没有症状的分组井编号检测，分组方法和检测方法同3.1。双抗体夹
4、心酶联免疫暖附测定。4 栓测与鉴定4.1 双抗体夹心酶联兔瘟眼附测定把制备的样品上清液加入己包被CPSMV抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA.每个样品平行加到两个孔中。设阴性对照和阳性对照健康的植物组织作阴性对照，感染了CPSMV的植物组织作阳性对照，其中阴性对照种类和材料(如种子或叶片应尽量与检测样品一致，样品提取缓冲液作空白对照，不同的检测试剂或试剂盒按说明操作。具体操作见附录B。4.2 RT-PCR 分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染CPSMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。GB/T 3180
5、5-2015 4.3 IC-RT Real-time PCR 分别提取样品和对照的总RNA，进行IC-RTreal-time PCR检测。健康的植物组织作阴性对照，感染CPSMV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录D.4.4 生物学测定样品按1:2，.1:10(质量z体积加入研磨缓冲液，在研钵中研碎。研碎后放人硅藻土浓度为0.5%)并与病汁穰混匀，接种到鉴别寄主上。具体操作参见附录E。5 结果判断样品经DA5-ELISA、普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性时，判定样晶未检出虹豆重花叶病毒。样品经DA5-ELISA检测结果为阳性，进一步用RT-PCR或实时荧光
6、RT守PCR方法进行检测。PCR结果为阴性，判定未检出虹豆重花叶病毒;PCR结果为阳性，可以判定为样品检出虹豆重花叶病毒。6 结果记录与梓晶保存6.1 结果记最完整的实验记录包括z样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要布经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据;PCR检测需有电泳结果图片及序列测定分析结果z实时荧光PCR需要有荧光曲线图与Ct值3生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。结果记录与资料保存期限至少1年。6.2 梓晶保存经检验确定携带CPSMV的样品应在合适条件下保存以备复核，种子保存在4.C，病叶冻干保存在一20C或者-80c冰箱中，做好标记和登记
7、工作。样品保存期限至少1年，2 附录A资料性附录E豆重花叶病毒相关资料A. 1 背景资料A. 1. 1 m亘重花叶病毒基本信息学名:Cowpea severe mosaic virus 缩写:CPSMV分类地位:m:豆花叶病毒属(Comovirus)成员。A.1.2 方法原理GB/T 31805-2015 虹豆重花叶病毒的分子生物学特性、血清学特性和生物学特性是本标准制定的主要依据。A.2 自然寄主莱豆(Phaseolusvulgaris)、大豆(Glycinemax)、绿豆(Vignaradiata)、虹豆(Vignasinensis)、长虹豆(Vignasesquicdalis)、毛蔓豆(
8、Caloogoniummucunoides)，直生刀豆(Canavaliaensiformi仆，距瓣豆(Centrosemapubescen仆，寂麻(Crotalariajuncea) , Desmodium canescens，大翼豆(Macroptilium lathyroides)，四棱豆(Psophocarustetragonolobus) ,Crotalaria paulinea。A.3 病害症状几乎所有的寄主在接种叶上形成褪绿斑或坏死斑，系统症状为斑驳或花叶，幼叶通常形成明显癌状突起、畸形。一些寄主表现系统坏死。大豆E在巴西，受侵染的大豆出现植株矮化、芽枯、结英数减少、产量降低s毛
9、蔓豆E出现严重花叶和痛状突起p距瓣豆z出现褪绿和花叶症状E蔬麻z叶片出现褪绿斑驳和畸形或褪绿斑症状z绿豆z叶片出现轻花叶和坏死斑症状zE豆2叶片出现褪绿花叶和严重畸形。A.4 分布美国、特立尼达(特立尼达和多巴哥共和国)、波多黎各岛、萨尔瓦多、哥斯达黎加、委内瑞拉、苏里南、巴西、秘鲁、墨西哥。A.5 传播途径CPSMV可以通过机械传播，花精、种子传播，旺豆的种传率为10%，长虹豆(Vignasesquipcdalis) GB/T 31805-2015 的种传率为8%;也可以通过甲虫传播，主要是叶甲科甲虫传播，大约有10种，菜豆叶甲(Ceratomatr去furcata)是最重要的传播介体，还可
10、以通过带斑黄瓜叶甲(Diabroticabalteata)和南美叶甲(D.srciosa)、Cerotomaruficornis等媒介昆虫传播。A.6 抗原特性CPSMV具有强免疫原性，容易制备高滴度的特异抗体。A.7 粒体形态病毒粒体为等轴对称二十面体，直径25nm.无包膜。A.8 基因组CPSMV基因组由2条RNA组成.RNA-1和RNA-2由不同的病毒粒子包裹.RNA1包裹在沉降组分B的粒子中，RNA2包裹在沉降组分M的粒子中。RNA-1长5957nt;RNA-2长3732 nt. 4 附景B(规范性附录双抗体夹心酶联免嬉眼附测定B.1 试剂B.1.1 包被抗体特异性的虹豆重花叶病毒抗体
11、。B. 1.2 酶标抗体碱性磷酸醋酶标记的虹豆重花叶病毒抗体。B.1.3 底物溶渡对硝基苯磷酸二锅(pNPP)100 mg溶解于底物缓冲液100mL中，现配现用。B.1.4 样晶抽提缓冲撞亚硫酸铀(Na2S03)1.3 g 聚乙烯毗咯烧酣(PVP)(MW24 000-40 000) 20.0 g 叠氧化铀(NaN3)0.2 g 吐温20(tween-20) 20 mL 溶于1L 1XPBST.调pH至7.4.4c冰箱保存。B.1.5 包被摄冲撞碳酸铺(Na2C03)碳酸氢铀(NaHC03)1.59 g 2.93 g 叠氮化铀(NaN3)0.2 g 溶于900mL蒸馆水，调pH至9.6.蒸锢水定
12、容至1L.4 C冰箱保存。B. 1.6 PBST缰冲撞(洗漏辑冲撞氯化铀(NaCl)磷酸氢二铀(Na2HP04)磷酸二氢饵(KH2P04)氯化御(KCl)8.0 g 1.15 g 0.2 g 0.2 g 吐温20(Tween-20)0.5 mL 溶于900mL蒸馆水，调pH至7.4.蒸锚水定容至1L.4 C冰箱保存。B. 1.7 酶栋抗体稀膺缓冲撞牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶精2.0 g 聚乙烯毗咯烧酣(PVP)(MW24 000-40 000) 20.0 g 叠氨化铺(NaN3)0.2 g GB/T 31805-2015 5 GB/T 31805-2015 榕于1L 1XPBST，调pH至
13、7.4，4C冰箱保存，B.1.8 J蓝物(pPP)缓冲谴溶于800mL蒸锢J15-10;重复性好。6 B.3.2 在满足了B.3.1质量要求后，结果作如下判断:样品OD405值/阴性对照OD值2.判为阳性z样品OD05值/阴性对照OD405值2，判为阴性p样品OD05值/阴性对照OD值接近2.判为可疑样品，需用其他方法验证。B.3.3 若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判定。GB/T 31805-2015 7 GB/T 31805-2015 C.1 试剂C. 1. 1 RNA提取试剂附录C规范性附录RT-PCR检测TrizoL裂解液、三氯甲饶、异丙自事、75%乙蹲。C. 1.2 反转
14、录试剂M-MLV反转录酶(200U/L)，5X反转录Buffer，dNTPOOmmol/L) , Rnasin (40 U/L)、焦磷酸二乙醋(DEPC)处理过的ddHzO.C. 1.3 PCR试荆10 X PCR Buffer、dNTPOOmmol/L)、DNA聚合晦(5U/L)。C.1.4 电津试剂C. 1.4. 1 50 X TAE Tris 242 g 冰醋酸57.1 mL 乙二股四乙踵二锅37.2 g 加去离子水定容至1L。用时加水稀释至1XTAE.C. 1.4.2 6 X加样缓冲渡0.25%澳酷蓝40%(质量z体相蔚糖水溶液C.2 实验步骤C.2.1 总RNA提取称取0.1g植物组
15、织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的1.5mL离心管中，加人1mL的TrizoL试剂，剧烈震荡摇匀，室温静置3min;4 C , 12000 g离心10min，取上清液:加人200L氯仿，上下颠倒混匀，室温静止3min;4 C , 12000 g离心10min，取上层水相p加等体积的异丙醇，颠倒混匀$4 C , 12 000 g离心10min，弃上清液dlU1 mL 75%的乙蹲洗涤沉淀，4C , 7 500 g离心5min，弃乙醇z沉淀于室温下充分干燥后，禧于30L经DEPC处理的ddHzO，一20C保存备用。C.2.2 RT-PCR反应C.2.2.1 I物与产物RT-PCR检测引物见表
16、C.1.8 . GB/T 31805-2015 表C.1PCR引物序列引物名称序列白-3) 扩增产物/bp上游寻l物CPSMV-356fACACARGTIMGICCIGAT AC ，其中R=A/G，I=IMP(次黄瞟岭核背酸)，M=C/A356 下游引物CPSMV-356rGCT ACIGGACTRCTRCTCA ，其中1=IMP(次黄瞟岭核背356 酸，R=A/GC.2.2.2 cDNA合成反转录总体系为12.5L.在PCR管中依次加入3L总RNA，1L下游引物CPSMV-356r(浓度为20pmo1/L)， 65 C温带7min，然后冰踏5min，瞬时离心，再向PCR管中加入下列试剂:M-
17、MLVRT(200 U/L) 0.5L、5xRT缓冲被2.5L、dNTP(10 mmo1/L) 0.5 ，.，.L、RNasin(40U/L) 0.5L、DEPC处理的ddH204.5L.反应参数:42C 60 min, 95 C 10 min。合成的cDNA于一20C冰箱保存备用。C.2.2.3 PCR扩增PCR反应体系见表C.2.反应参数:94C 3 min, 94 C 45 s, 52 C 45 s , 72 C 1 min，35个循环$72 C延伸7min. 试剂名称10XPCR Buffer dNTPOO mmo!/L) CPSMV-356f(20 pmo!/U -一-一CPSMV-
18、356r(20 pm(ll! DNA聚合酶(5U/L) cDNA模板ddHzO C.2.3 琼脂糖电珠C.2.3.1 制备凝股表C.2PCR反应体系加样量/L2.5 1.0 1.0 1.0 0.2 3.0 补足反应总体积至25L将1XTAE和电泳级琼脂糖按1.5%(质量=钵积配好，在微波炉中熔化混匀，冷却至55C左右，加入澳化乙键浓度为0.5g/mL)，混匀，倒入已封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，从制脏平台上除去封带，拔出梳子，加入足够量的TAE(缓冲液没过凝肢表面约1mm)。C.2.3.2 加榨取8LPCR产物与加样缓冲液按规定比例混匀，加入到琼脂糖凝肢孔中，使用的DNA标准分子
19、量应与目的片段大小相匹配。9 GB/T 31805-2015 C.2.3.3 电泳接通电源，以5Vjcm(正、负极之间的距离)的电压进行电泳，当指示剂迁移至足够分离DNA片段时，关闭电源。将整个脏置于凝胶成像仪上观察。C.3 结果判定如果阳性对照出现356bp的条带，检测样品、阴性对照和空白对照未出现条带，可判定样品为阴性。如果阳性对照及检测样品出现约356坤的条带，阴性对照和空白对照未出现条带，可判定样品为阳性。10 GB/T 31805-2015 附录D(规范性附最IC-RT real time PCR栓测D.l 试剂CPSMV抗体、包被缓冲液和PBST试剂见B.1，RNA提取和cDNA合
20、成试剂见C.1.1;2X FastStart Universal Probe Mast(rox). D.2 实验步骤D.2.1 包髓抗体根据检测试剂说明，将包被抗体用包被缓冲液稀释如1I 200)，取25L稀释好的包被溶液于PCR管中。25C中放置3h或4C冰箱中过夜，用PBST缓冲被洗襟3吹5次，去除残留溶液。D.2.2 抗原捕捉向每个已包被抗体的离心管中加入捡割样品上清液25L.25C下放置2h-3h或4C冰箱中放置过夜dJn入PBST缓冲液洗涤3次5次，灭菌双蒸水洗海2次，去除残留潜液。注g如果是用于验证DAS-ELlSA的检测结果，可直接使用血清学检测样品的剩余提取液。D.2.3 cD
21、NA合成在己制备好的免疫捕获PCR管中加入z特异性下瓣引物CPSMVR(20mol/L)0.5L及无RNA酶ddHzO8.5L.在PCR仪上95C处理5min.迅速冷却后，再向PCR管中加入下列试剂:M-MLVRT(200 U/L) 0.5L、5XRT缓冲被2.5L、dNTP(10 mmol/L) 0.5L、RNasin(40U/L) 0.5L。反应参数:42C 60 min, 95 C 10 min.加入剩余反转录(RT)反应液进行反转录.42C , 60 min。反转录总体积10L。D.2.4 Real-time PCR栓副D.2.4.1 I物与探针引物和探针序列见表D.1。囊D.1 引物
22、和探针序列及其在基因组中的位置寻|物名称序列CPSMVF 5 -GGTCAATCCCGGCATT A TTG-3 CPSMVR 5 -GGCTTCTGCAGGTGTTCCAA-3 CPSMVPro 5 (FAM)-TGT AGCACAA TCAGGGCAAACACAGCA-(T AMRA) 3 D.2.4.2 反应体系实时荧光PCR反应体系见表D.2.11 GB/T 31805-2015 表D.2实时荧光PCR反应体系试剂名称加样量/L2 X FastStart Universal Probe Mast(rox) 10.0 cDNA 2.0 CPSMVF(20mol/L) 0.4 CPSMVR
23、(20mol/L) 0.4 CPS如IVPro(20mol/L)0.1 DEPC处理水补足反应总体积至20LD.2.4.3 反应参鼓反应条件为:94C 3 min;94 C 15 s ,60 c 60 s，45个循环。D.3 结果判定检测样品的Ct值大于或等于40时，则判定虹豆重花叶病毒阴性。检测样品的Ct值小于或等于35时，则判定直豆重花叶病毒阳性。检测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值大于或等于40时，则判定旺豆重花叶病毒阴性F如果重新测试的Ct值小于40，则判定虹豆重花叶病毒阳性。12 E.1 鉴别寄主附录E(资棉性附录生糊学测定GB/T 31805-
24、2015 克色事(Chenoodiumamaranticolor)、菜豆(Phaseolusvulgaris)品种Pinto、虹豆(Vignaun guiculata)品种BlackeyeEarly Ramshorn. E.2 方法E.2.1 研磨样品按1I 2 1 I 10 (质量=体积加入0.01mol/L磷酸铀缓冲液(pH7.2)研磨，在研钵中研碎。研碎后放入硅藻士浓度为0.5%)并与病汁液混匀。E.2.2 接种宽色葱接种苗龄:4片6片真叶p菜豆(Phaseolusvulgaris)品种Pinto接种苗龄2子叶期或第一片真叶出现z虹豆(Vignaunguiculata)品种Blackey
25、eEarly Ramshorn接种苗龄E子叶期或第一片真叶出现.先将要接种的植株叶片用牙签等穿孔作为接种叶片的标记，然后用手将样品汁被轻轻涂抹于鉴别寄主叶片上表面，用蒸懵水冲洗叶表面。做好标签，置于隔离温室中在自然光照下，温度控制在20 C30 .C)，及时观察记载寄主反应。E.3 鉴别寄主症状克色黎E接种叶出现坏死斑症状，没有系统症状。菜豆(品种Pinto):接种叶出现坏死斑症状，没有系统症状。E豆晶种BlackeyeEarly Ramshorn) :接种叶出现褪绿斑症状，并且通常有红色坏死斑，有的主要叶脉变成红色和坏死，系统症状为花叶、黄脉、畸形、坏死。13 巴ON|的。FmH函。华人民共和国家标准E宣重花叶病毒幢瘟蜂起方法GB/T 31805-2015 国中 中国标准出版社出版发行北京市胡阳区和平墨西街甲2号(100029)北京市西城区三旦河北街16号(10004日网址总编室:(010)68533533发行中心:(010)51780238读者服务部1(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张1.25字数22千字2015年9月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2015年9月第一版铃21. 00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价号:155066. 1-52419
