1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 31806-2015 马铃薯V病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Potato virus V 2015-07-03发布2015-11-27实施?飞中华人民共和国国家质量监督检验检费总局峪舍?句:和中国国家标准化管理委员会6l.1)1 GB/T 31806-2015 前盲本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由全国撞物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位z中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本标准主要起草人z
2、李桂芬、李星、马洁、鲁洁、张永江、孔君、魏梅生，I GB/T 31806-2015 马铃薯V病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了植物检疫中马铃薯V病毒的检疫鉴定方法。本标准适用于马铃薯块茎、组培苗等繁殖材料中马铃薯V病毒的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 仪器设备及试剂3.1 仪器设备酶标仪、天平(感量1/10000g)、pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统
3、、隔离温室、恒温水路、低温冰箱等。微量移被器(2L，10L，20L，100L，200L，1000L)、酶联板、研钵、离心管、花盆、灭菌土等。3.2 试割酶联免疫吸附测定试剂见附录B，RT-PCR检测试剂见附录C，实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D，生物学测定试剂参见附录E.4 抽样与样品制备4.1 抽样抽样按照SN/T2122的规定进行。4.2 马铃薯块茎样晶的制备将马铃薯块茎播于灭菌土中，于25c生长并进行症状观察。待长出约10片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(10株为一组并编号。采集叶片用于酶联免疫测定、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测及生物学测定。4.3 组培
4、苗样晶制备将每瓶组培苗中的每个植株都进行采样，每瓶组培苗所采样品作为一个加样样品用于酶联免疫测定、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测及生物学测定。1 GB/T 31806-2015 5 档测方法5.1 酶联免擅眼附副定见附录B.5.2 RT-P栓测见附录C.5.3 实时荧光RT-PCR检测方法见附录D.5.4 生物学测定参见附录E。6 结果判定样品经酶联免疫吸附测定为阴性或RT-PCR检测为阴性或实时荧光RT-PCR检测为阴性，判断待检样品不携带马铃薯V病毒。样品经酶联免疫吸附测定为阳性.RT-PCR检测或实时荧光RT-PCR检测为阳性，即可判断待检样品携带马铃薯V病毒。必要时可进行生
5、物学测定。7 梓晶保存与结果记录7.1 样品保存经检测确定携带马铃薯V病毒的样品应在合适的条件下保存，块茎可在4oc保存6个月，组培苗可在一20.C或-80c冰箱中保存1年，做好标记和登记工作。7.2 结果记录完整的记录包括z样品的来摞、时间、地点、方法和结果等，并应有经手人和实验人员的签字。酶联测定应有酶联板反应的原始数据.RT-PCR检测应有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR检测应有反应原始数据，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。2 GB/T 31806-2015 附录A(资料性附录马铃薯V病毒相关资料A. 1 背景资料A. 1. 1 基本信息学名IPotato virus V.缩写:pv
6、v.分类地位z马铃薯Y病毒科(Potyliridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。A. 1.2 方法原理根据马铃薯V病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行ELISA检测s根据该病毒核酸的序列进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定s根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过检测的荧光信号进行结果判定。条件允许的情况下，根据马铃薯V病毒侵染寄主的症状特点，进行生物学检测。A.2 寄主范围马铃暮V病毒自然侵染仅限马铃薯。A.3 病害症状侵染的植株叶片灰白，新生叶变小，轻度扭曲，可能发展为花叶和坏死斑。A.4 分布地区分布于秘鲁、法国、荷兰和英国。A.5 传播方式蜻虫传
7、播，传播马铃薯V病毒的蜻虫种类为My归zusersi比cae、Brachycaudu削sh归elichrysihum eUJhorbi臼ae、Rhoal归OsthoninuslatysiJho A.6 粒体形态线状粒体，直径11nm-13 nm.主体长度为760nm. 3 GB/T 31806-2015 附录B规范性附景)酶联免瘟眼附测定B.1 试剂B. 1. 1 抗体DAS-ELISA方法z包被抗体为多克隆抗体，检测抗体为多克隆抗体酶标抗体。B.1.2 底物对硝基苯磷酸二铀(pNPP)0B.1.3 包被罐冲波(pH9.6) 碳酸铀(NaaC03)1.59g 碳酸氢锅(NaHC03)2.93
8、g 叠氮铀(NaN3)0.20 g 蒸锚水定容至1L.4 C储存。B.1.4 PBST缓冲撞(pH7.的氯化铀(NaCl)8.0 g 0.2 g 磷酸二氢愣(KH2P04)磷酸氢二铀(NazHP04)氧化饵(KCD吐温-20(Tween-20) 叠氨铀(NaNa)蒸懵水定容至1L。1.15 g 0.2 g 0.5 mL 0.2 g B.1.5 梓晶抽提缓冲灌(pH7.的PBST 1 L 亚硫酸铺(Na2S03)1.3 g PVP(MW24 00040 000) 20.0 g 叠氮销(NaN3)0.20 g 4 C储存。B.1.6 酶标抗体稀膺缓冲滚(pH7.4) PBST 1 L BSA(牛血
9、清白蛋白)2.0 g PVP(MW24 00040 000) 20.0 g 叠氯铀(NaN3)0.2 g 4 C储存。4 . GB/T 31806-2015 B. 1.7 底物摄冲撞(pH9.8) 二乙蹲腊97 mL 氯化镜(MgC12)0.1 g 叠氨销(a3)0.2 g 榕于800mL蒸锢水，用盐酸调pH值至9.8，然后用蒸锢水定容至1L. 4 C储存。B.2 试验步黯B.2.1 包被抗体按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100L.酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在37C孵育2h .清空孔中榕攘，用PBST加满各孔，3tnin后倒掉孔中癖液，在吸水纸上拍干。再重复2次上述
10、洗板过程。B.2.2 样晶制备与加样待测样品按1: 10(质量:体积)加入抽提缓冲液，在研钵中研磨.20r/mn离心10min，上清液即为制备好的检测样晶。阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行。加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，100L/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在4C孵育过夜.酶联板用自来水彻底冲洗，再用PBST洗涤3次，每次3min. B.2.3 加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释重工作浓度并加入到酶联板中，100L/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好，37C.4 h。酶联板用自来水彻底冲洗，再用PBST洗海3肢，每次3min. B.2.4 加底物将底物pPP
11、加入到底物缓冲液中使终榷度为1mg/mL(现配现用)，100L/孔加入到离联板中，室温避光膊育。B.2.5 读数在不同的时间内如30min、60min、min，120min或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值。B.3 结果判定对照孔的OD405值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应该在质量控制范围内，即z缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值5;同一样品的重复性基本一致。在满足了上述的质量要求后，结果原则上可判断如下:样品00.值/阴性对照OD405值明显2，判为阳性z样品OD值/阴性对照00.值在2左右，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证s样品OD405值/阴性对照OD4值明
12、显2，判为阴性。若满足不了上述的质量要求，则不能进行结果判断。5 GB/T 31806-2015 C.1 试剂C.1.1 核酸提取试1fIJ核酸提取试剂为TRlzol试剂。C.l.2 50xTAE 三握甲基氨基甲烧(Tris)冰乙酸附录C(规范性附录)RT-PCR检测242 g 52.1 mL 乙二肢四乙酸二铀(EDTA.2H20)37.2 g 加蒸铺水至1L。用时加蒸锢水稀释至1XTAEoC.l.3 6x加样锺坤攘0.25%澳酣蓝s40%(质量分数藤糖水溶液.C.2 试验步骤C.2.1 总RNA提取取0.1g样品，加人1mL TRlzol试剂充分研磨，室温放置5min;12 000 g离心5
13、min.取上清液到另一离心管中F加入三氯甲烧500L.充分振荡15s.室温放置3min; 12 000 g.4 C离心15min;取上层水相加入另一离心管中，加入等体积异丙靡;12 000 g. 4 C离心10min.弃去上清擅s加入1mL 70%乙蹲洗涤;RNA沉淀干燥后，加经过焦破酿二乙醋(DEPC)处理的ddH2040L榕解即可。C.2.2 引物序列根据马铃薯V病毒的CP基因序列(GeneBank序列号，X61279.1)设计引物对如下EPVV-CP-F:5-CGT ATG AAG TCA GAC ATC AAG CAA A-3(位置1219 nt.1 243 nt) PVV-CP-R,
14、 5-AAA GCT AGT ACG AAG AAA AGC CAA AC-3 (位置2107 nt.2 132 nt) 预期扩增大小为914bp。C.2.3 反转录反转录体系20LoDEPC-HaO 10L.10 mmol/L dNTP 1L.20mol/L下游引物2L.RNA模板1L.70C反应5min.冰上放置5min.b人反转录酶5倍缓冲液4L.200U/L反转录酶1L.40 U/LRNA晦抑制剂1L.42c反应1h。C.2.4 PCR扩增反应体系20L。上述反转录产物2L.10倍PCR缓冲液(含Mg2+)2L.10 mmol/L dNTP 6 GB/T 31806-2015 0.5L
15、.上游引物0.5L，下带引物0.5L.2U/L Taq DNA聚合酶1L和DEPC水13.5L.检测时以含PVV的植物材料的DNA或含有PVV目标片段的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替DNA模板作为空白对照。反应程序为:95C 5 minl94 C 30 s,55 C 30 s,72 C 1 min. 35个循环;72C 7 min. C.2.5 琼脂糖摄胶栓测用1XTAE配制1%琼脂糖凝肢，加热禧化后冷却至55C左右。将凝胶倒人凝胶槽中，插上样品榄子。冷却凝固后拨掉梳子，在电泳槽内加入1XTAE，缓冲液要没过凝胶表面约1mm. 将加样缓冲液与样品混合后加人样品孔，同时设
16、计PCR的阴性对照和阳性对照，并加人DNA相对分子质量标准物。接通电源，以3V /cm-5 V /cm电场强度进行电泳，0.5h后观察结果。电泳结束后，将凝胶放入0.5g/mL的漠化乙键(EB)染色液中染色10min 15 min.将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察，记录结果。C.3 结果判定阳性对照在914bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。阳性对照在914bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，且待测样晶在914bp处无扩增条带，判定结果为阴性。7 GB/T 31806-2015 附录D规范性附录实时英先RT-PCR
17、捡回方法D.1 主要试剂D.1.1 RNA提取试剂TRlzol试剂、兰氯甲饶、异丙酶、70%乙醇。D.1.2 实时荧光RT-PCR试剂TaqMan Onstep RT-PCR Mixture. D.2 iJl物探针根据马铃薯V病毒的CP基因序列(GeneBank序列号:X61279.D设计引物对如下zPVV-F:5-CGGTATGGTTTGGTGAGAAATTTGC-3 (位置1800 nt-1 824 nt) PVV-R:5-ACCATCCAATCCAAACAAGCGAGT-3 (位置1941 nt-1 964 nt) PVV-Probe:5-FAM-TCCCGCACATCCGTCCGAGC
18、AC-TAMRA-3 (位置1872 nt-1 893 nt) D.3 核酸提取取0.1g样品，加入1mL TRIzol试剂充分研磨，室温放置5min;1 2 000 g离心5min，取上清液到另一离心管中dJ人三氯甲烧500L.充分振荡15s.室温放置3min;12 000 g.4 C离心15min;取上层水相加入另一离心管中，加入等体租异丙醇;12000g.4 c离心10min.弃去上清液;:1m人1mL 70% 乙醒t!涤IRNA沉淀干燥后，加经过焦碳醺二乙醋(DEPC)处理的ddH2040L溶解即可。D.4 实时荧光RT-PCR反应反应体系:0.2mL离心管中加人2X One Step
19、 RT-PCR缓冲液m10L.Ex TaqHS(5 U/L) 0.4L，PrimeScript RT Enzyme Mix n 0.4L，PVV-FOOmol/L) 0.4L， PVV-R(10mol/L) 0.4L，PVV-ProbeOOmol/L)0.6L，ROX Reference Dye H 0.4L，模极RNA2L，补DEPCH20至20L.设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应程序:42C 10 min;95 c 10 s,95 C 15 s.60 C 1 min，40循环。PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整，也可采用商业化试剂盒。D.5 结果判定在阳性对照Ct
20、值小于30，空白对照Ct值等于40的条件下若不满足该两项条件，此次检测无效，应重做荧光PCR扩增): a) 待测样品的Ct值为40时，判定待测样品为PVV阴性。8 GB/T 31806-2015 b) 待测样品的Ct值小于或等于35时，判定待测样品为PVV阳性。c) 待测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试s如果重新测试的Ct值为40时，判定PVV阴性F如果重新测试的Ct值小于40，则判定PVV阳性。9 GB/T 31806-2015 E.1 试材E. 1. 1 鉴别寄主附录E(资料性附录)生物学测定心叶烟(Nicotianaglutinosa)、克利夫兰烟(N.cleveland
21、ii)、本生烟(N.benthamiana)、德民烟(N. debneyi)、白胁烟(N.tabacum cv. White Burley)。接种叶龄:5.，8片叶。E.1.2 试剂。.2mol/L的磷酸盐缓冲液(pH8.0)。E.2 方法E.2.1 研磨病样加1: 5(质量E体积)的0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)，在研钵中研碎。研碎后放人桂藻土或金刚砂，浓度为0.5%，与病汁液混匀。E.2.2 接种用手将病汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶表面。E.2.3 冲就用自来水冲洗叶表面。E.2.4 观察每天观察记载寄主反应，连续观察1个月。E.3 鉴别寄主症状E.3.1 心叶烟E系统症状为明脉和
22、花叶。E.3.2 克利夫兰烟E系统花叶症状。E.3.3 本生烟z顶部茎萎藩和系统花叶症状。E.3.4 德民烟z接种叶症状为褪绿斑，系统症状为明脉、花叶、褪绿斑、褪绿环。E.3.5 白肋烟z系统症状为明脉和花叶。10 山FONlgFmh筒。华人民共和国家标准马铃薯V病毒检瘟鉴定方法GB/T 31806-2015 国白铮中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西械区三星河北街16号(10004日网址总编室:(010)68533533发行中心:(010)51780238读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1字数22千字2015年8月第一版2015年8月第一次印刷* 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价H号:155066. 1-49516 GB/T 31806-2015
