1、ICS 13. 100 C 52 , 中华人民共和国国家职业卫生标准GBZ/T 240.23-2011 化学晶毒理学评价程序和试验方法第23部分:迟发性神经毒性试验Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals 一Part 23: Delayed neurotoxicity test 2011-08-19发布2012-03-01实施中华人民共和国卫生部发布数码防伪/ 目U吕根据中华人民共和国职业病防治法制定本部分。GBZjT 240(化学品毒理学评价程序和试验方法现分为以下四十四部分z第1部分:总则;一一第2部分:
2、急性经口毒性试验;一一第3部分:急性经皮毒性试验;一一第4部分:急性吸入毒性试验;一一第5部分:急性眼刺激性/腐蚀性试验;一一第6部分:急性皮肤刺激性/腐蚀性试验;一一第7部分:皮肤致敏试验;一一第8部分:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验;第9部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验;一一第10部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验;一一第11部分:体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验;一一第12部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验;十一第13部分:哺乳动物精原细胞/初级精母细胞染色体畸变试验;第14部分:啃齿类动物显性致死试验;第15部分:亚急性经口毒性试验;第16部分z亚急性经皮毒性试验;第17部分
3、:亚急性吸人毒性试验;一一一第18部分:亚慢性经口毒性试验;一一第19部分:亚慢性经皮毒性试验;一一第20部分z亚慢性吸入毒性试验;一一第21部分:致畸试验;一一第22部分:两代繁殖毒性试验;一一第23部分:迟发性神经毒性试验;一一第24部分z慢性经口毒性试验;第25部分:慢性经皮毒性试验;一一第26部分:慢性吸入毒性试验;一一第27部分:致癌试验;一一第28部分:慢性毒性/致癌性联合试验;一一第29部分:毒物代谢动力学试验;一一第30部分:皮肤变态反应试验-局部淋巴结法;一一第31部分z大肠杆菌回复突变试验;第32部分:酵母菌基因突变试验;一一第33部分:果蝇伴性隐性致死试验;一一第34部分
4、z枯草杆菌基因重组试验;第35部分:体外哺乳动物细胞程序外DNA合成(UDS)试验;第36部分z体内哺乳动物外周血细胞微核试验;GBZjT 240.23-2011 I GBZ/T 240.23-2011 一一-第37部分z体外哺乳动物细胞姊妹染色单体交换试验;第38部分z体内哺乳动物骨髓细胞姊妹染色体交换试验;第39部分z精子畸形试验;第40部分:繁殖/生长发育毒性筛选试验;第41部分z亚急性毒性合并繁殖/发育毒性筛选试验;一一第42部分=一代繁殖试验;一一第43部分z神经毒性筛选组合试验;一一第44部分:免疫毒性试验。本部分为GBZjT240的第23部分。本部分由卫生部职业卫生标准专业委员会
5、提出。本部分由中华人民共和国卫生部批准。本部分起草单位:山东省职业卫生与职业病防治研究院、中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本部分主要起草人:陶玉珍、李斌、孙金秀、林铮。E 1 范围化学品毒理学评价程序和试验方法第23部分:迟发性神经毒性试验GBZ/T 240.23-2011 GBZ/T 240的本部分规定了动物迟发性神经毒性试验的目的、试验概述、试验方法、数据处理与结果评价、评价报告和结果解释。本部分适用于有机磷化合物的迟发性神经毒性测定。若某些受试样品的化学结构式与迟发性神经毒性阳性物质相似，也需进行此项试验。试验分为急性和亚急性迟发性神经毒性试验。2 规范性引用文件下列文件对于本
6、文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBZ/T 224 职业卫生名词术语GBZ/T 240.1 化学品毒理学评价程序和试验方法第l部分:总则3 术语和定义GBZ/T 240.1界定的术语和定义适用于本文件。3. 1 有机磷引起的迟发性神经毒性organophosphorus induced delayed neurotoxicity, OPIDN 一种神经综合征，主要的临床症状为四肢元力、上位运动神经元损伤性瘟孪，其相关的病理学症状是周围神经和脊髓远端轴突病，生化作用是神经组织中的神经病
7、靶醋酶(neuropathytarget esterase, NTE)抑制和老化。暴露引起的NTE抑制和随后的老化，其临床体征和病理改变首先见于第1周2周间。3.2 神经病靶醋酶neuropathy target esterase, NTE 又称神经毒性醋酶(neurotoxicesterase)是膜结合蛋白，催化戊酸苯醋水解。该酶与有机磷共价结合发生磷酷化后，即被抑制或老化，与OPIDN之间有着密切关系。并不是所有抑制NTE的有机磷都能引起OPIDN，但是所有引起OPIDN的有机磷都能抑制NTE。4 试验目的检测和评价受试样品是否具有迟发性神经毒性作用。迟发性神经毒性作用主要表现为运动性共济
8、失调和瘫痪，在组织病理学上神经组织呈脱髓鞠变化。5 试验概述在急性迟发性神经毒性试验中，高剂量采用最大耐受剂量，一次给药后观察21d。在亚急性神经毒1 GBZ/T 240.23-2011 性试验中，连续给药28d后，继续观察14d。试验期间需对动物全面观察，内容包括:行为异常、运动失调、瘫痪等，试验中定期进行生化检验，特别是NTE测定，并于试验结束时进行神经组织的病理学检查等。6 试验方法6. 1 急性迟发性神经毒性试验6. 1. 1 实验动物选用8个月12个月健康成年母鸡，元用药史、元步态异常，体重1500 g2 000 go受试样品组和介质对照组每组至少12只，阳性对照组至少6只。试验前置
9、于试验环境中观察适应3d。6. 1. 2 饲养条件单笼饲养，饲养的笼子应足够大，允许母鸡自由行动，并可观察其步态。如果是人工照明，应12h 照明，12h黑暗，适当饮食，不限制饮水。6. 1. 3 试验分组6. 1. 3. 1 一般设3个4个剂量组，每一剂量组动物要保证至少有6只动物用于生化指标检验，6只动物用于病理解剖。6. 1. 3. 2 先求出受试样品对母鸡的急性经口半数致死量(LD川。6. 1. 3. 3 剂量范围可在半数致死量和NOAEL之间设定，应包括人类实际接触量及其100倍剂量。6. 1. 3. 4 当受试样品剂量达每日1000mg/kg体重，动物未出现毒性效应，更高的剂量则不予
10、考虑，但当人的实际接触剂量较大时，可考虑适当加大剂量。6. 1. 3. 5 介质对照组除不给受试样品外，其他与受试样品组完全一致。6.1.3.6 阳性对照组要保证至少有6只母鸡(3只用于生化检验，3只用于病理解剖)给予迟发性神经毒性阳性物，如三邻甲苯磷酸醋(tri-o-cresylphosphate，TOCP) ，剂量为500mg/kg体重。也可采用近期的阳性对照数据。6.1.4 试验步骤6. 1. 4. 1 动物准备试验前动物隔夜禁食，但不限制饮水。6. 1. 4. 2 受试样品的配制受试样品采用水溶液、棍悬液或油溶液。灌胃量可根据各组不同剂量按5mL/kg体重给予。如采用注射给药，一般按1
11、mL/kg体重给予。6. 1. 4. 3 染毒通常采用一次经口灌胃给药，也可采用胶囊或母鸡翅膀下注射给药。给予受试样品前10min 15 min应大腿肌肉注射硫酸阿托品作保护处理，用量为10mg/kg体重，以对抗急性副交感神经中毒症状，同时肌肉注射解磷定25mg/kg体重，以防止对胆碱醋酶的不可逆抑制。2 GBZ/T 240.23-20门6.1.5 观察指标6. 1. 5. 1 临床观察6. 1. 5. 1. 1 给予受试样品后直到21d每天至少观察一次，记录有无行为异常，运动性共济失调，瘫痪等症状。在开始给予受试样品的两天应每天至少观察3次5次。6. 1. 5. 1. 2 详细记录包括出现中
12、毒症状的时间、程度及持续时间。6. 1. 5. 1. 3 每周至少两次将母鸡拿出笼子强迫活动，以观察有无迟发性神经毒性的最小反应。6. 1. 5. 1. 4 每周测体温一次、称体重一次、记录食量一次。6. 1. 5. 1. 5 出现濒死状态的鸡应立即处死，解剖检查。6. 1. 5. 1. 6 共济失调按以下5级进行记录:一一0元反应;A 腿软、站立姿势和步态稍异常;-B 步态严重异常，行走时不断跌倒;一一-c 能勉强站立，但多以足站立;一一D不能站立，通过扇动翅膀移动身体。6. 1.5.2 生化检验给予受试样品24h、48h后分别从各剂量组和介质对照组中随机选择3只母鸡处死，阳性对照组随机选择
13、3只母鸡于24h处死，取脑和腰脊髓进行NTE测定，如果观察临床症状出现缓慢，可适当延迟测定时间处死动物。必要时可测定这些样品中的乙酷胆碱醋酶(AChE)0所有解剖的动物应仔细观察脑和脊髓的形态学改变情况。6.1.5.3 病理组织学检查6.1.5.3.1 观察期结束后将每组剩余的母鸡用空气栓塞法或颈动脉放血法，迅速解剖取材，或用原位灌注固定法处死。6. 1.5.3.2 主要对脑、脊髓及远端周围神经组织进行病理组织学检查:一一脑:包括延脑、脑桥、小脑及大脑皮质;一一脊髓:包括颈段，胸段中部及腰慨结合部;一一周围神经:坐骨神经，腔骨神经及其侧支。6. 1. 5. 3. 3 神经组织切片染色除常规苏木
14、精伊红(HE)染色外，同时要进行髓黯或轴索等特殊染色。6.2 亚急性迟发性神经毒性试验6.2.1 动物同急性迟发性神经毒性试验(见6.1.1)。6.2.2 饲养条件同急性迟发性神经毒性试验(见6.1. 2)。6.2.3 试验分组设3个剂量组和1个介质对照组。每组应有足够的母鸡数，保证至少有6只用做生化检验，6只于末次给药后继续观察并于试验结束时进行病理形态学观察。剂量选择应参考急性毒性测试结果和有关资料:3 GBZ/T 240.23-2011 高剂量应引起明显的毒性效应，但不能引起死亡或严重伤害。中剂量应出现极轻微中毒变化。低剂量不应出现任何毒作用。如果1000mg/kg体重未产生可观察到的毒
15、性作用，则不必进行更高剂量的测试。但当预期的人接触量高于此剂量时则应加大剂量进行测试。6.2.4 试验步骤6.2.4. 1 受试样晶配制首选灌胃或胶囊给药。受试样品采用水溶液、混悬液或油溶液。灌胃量可根据各组不同剂量按5 mL/kg体重给予。6.2.4.2 染毒每日一次经口给药，每周7d，连续28d，末次给药后继续观察14d。6.2.5 观察指标6.2.5. 1 临床指标给药期间和观察期间每天至少观察一次，记录有元行为异常，运动性共济失调，瘫痪等症状。具体观察和记录见6.1.5. 10 6.2.5.2 生化检验观察期间进行生化检验，分别于末次给药后24h和48h各从每个受试样品组和介质对照组随
16、机选择3只母鸡进行NTE和AChE测定。6.2.5.3 病理组织学检查观察期满处死剩余母鸡，每组6只解剖取脑、脊髓及远端周围神经组织进行病理组织学检查。见急性迟发性神经毒性试验(见6.1. 5. 3)。7 数据处理与结果评价7. 1 数据处理将受试样品组与阳性对照组、介质对照组做比较，进行统计分析，以确认是否有迟发性神经毒作用。7.2 结果评价7.2. 1 评价内容包括临床神经毒性症状、生化检验和病理检查结果及可观察到的其他毒性效应。对发生率、严重程度及相关性作出评价。7.2.2 阳性对照组应出现共济失调障碍，病理组织学证实有脱髓黯改变，介质对照组元上述改变。7.2.3 出现阳性时，需求得无作
17、用剂量，进一步评价受试样品与神经毒性的反应关系、发生率和严重程度。7.2.4 评价要列出以下简表，包括:4 a) 一般症状变化，出现神经毒性症状的类型、严重程度，计算出百分率、死亡率、体重变化、摄食量;b) 食物利用率:(每周平均增加体重/每周平均进食量)X 100%; 生化检验结果;一一病理组织学检查结果及照片。8 评价报告除GBZ!T240.1规定的一般项目外，评价报告还应包括以下内容za) 体重的数据;GBZ/T 240.23-20门b) 各剂量的毒性效应，数据包括死亡情况;临床症状的性质，严重程度和持续时间(元论是否可逆); c) 生化检验方法和结果:详细描述pd) 尸检结果;e) 所
18、有病理组织学检查的详细结果FD 结论。9 结果解释迟发性神经毒性试验能够提供受试样品急性或亚急性染毒的迟发性神经毒性作用资料。虽然其试验结果仅能有限地外推到人，但它可为确定人群接触的元作用水平和允许接触水平提供有价值的信息。5 FFON-R.O叮NHN阁。华人民共和国家职业卫生标准化学晶毒理学评价程序和试验方法第23部分:迟发性神经毒性试验GBZ!T 240.23-2011 国中* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数11千字2011年10月第一次印刷开本880X12301/16 2011年10月第一版* 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价书号:155066. 2-22236 GBZ/T 240.23-2011 2011年11月1日F002打印H期:
