1、ICS 13.100 C 52 , 中华人民共和国国家职业卫生标准GBZ/T 240. 8-2011 化学晶毒理学评价程序和试验方法第8部分:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals一Part 8: Salmonella typhimurium reverse mutation assay 2011-08-19发布2012-03-01实施中华人民共和国卫生部发布室主问i坊钩, 中华人民共和国国家职业卫生标准化学晶毒理学评价程序和试验方法第8部分:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验GBZ/T
2、240.8-2011 告岳中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张O.75 字数17千字2011年10月第一版2011年10月第一次印刷唔书号:155066. 2-22221定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533目U吕根据中华人民共和国职业病防治法制定本部分。GBZjT 240(化学品毒理学评价程序和试验方法现分为以下四十四部分:一一第1部分:总则;一一第2部分:急性经口毒
3、性试验;一一第3部分:急性经皮毒性试验;第4部分z急性吸人毒性试验;第5部分z急性眼剌激性/腐蚀性试验;一一第6部分z急性皮肤剌激性/腐蚀性试验;第7部分:皮肤致敏试验;一一-第8部分:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验;一一第9部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验;第10部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验;第11部分:体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验;第12部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验;一一第13部分:哺乳动物精原细胞/初级精母细胞染色体畸变试验;一一第14部分:啃齿类动物显性致死试验;一一第15部分:亚急性经口毒性试验;一一第16部分z亚急性经皮毒性试验;一一第17部分:亚急性吸入
4、毒性试验;第18部分:亚慢性经口毒性试验;一一第19部分:亚慢性经皮毒性试验;一一第20部分:亚慢性吸入毒性试验;一一第21部分:致畸试验;一一第22部分:两代繁殖毒性试验;一一第23部分:迟发性神经毒性试验;一一第24部分z慢性经口毒性试验;一一第25部分:慢性经皮毒性试验;一一-第26部分z慢性吸入毒性试验;一一第27部分:致癌试验;第28部分:慢性毒性/致癌性联合试验;一一第29部分:毒物代谢动力学试验;一一第30部分:皮肤变态反应试验-局部淋巴结法;一一一第31部分:大肠杆菌回复突变试验;一一第32部分:酵母菌基因突变试验;一一第33部分z果蝇伴性隐性致死试验;一一第34部分:枯草杆菌
5、基因重组试验;一一第35部分z体外哺乳动物细胞程序外DNA合成(UDS)试验;第36部分:体内哺乳动物外周血细胞微核试验;GBZjT 240. 8-20门I GBZ/T 240. 8-2011 E 一一第37部分z体外哺乳动物细胞姊妹染色单体交换试验;一一第38部分:体内哺乳动物骨髓细胞姊妹染色体交换试验;一一第39部分:精子畸形试验;一一第40部分:繁殖/生长发育毒性筛选试验;一一第41部分:亚急性毒性合并繁殖/发育毒性筛选试验;一一第42部分:一代繁殖试验;一一第43部分:神经毒性筛选组合试验;第44部分:免疫毒性试验。本部分为GBZlT240的第8部分。本部分的附录A是资料性附录。本部分
6、由卫生部职业卫生标准专业委员会提出。本部分由中华人民共和国卫生部批准。本部分起草单位:广西职业病防治研究所、中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本部分主要起草人:陈晓琴、许建宁、孙金秀、林铮。GBZ/T 240. 8-2011 1 范围化学晶毒理学评价程序和试验方法第8部分:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验GBZ/T 240的本部分规定了鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)的试验目的、试验概述、试验方法、结果评价、评价报告和结果解释。本部分适用于检测化学品(有杀菌作用的除外)的致突变性。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本
7、文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBZ/T 224 职业卫生名词术语GBZ/T 240.1 化学品毒理学评价程序和试验方法第l部分:总则3 术语和定义GBZ/T 240.1界定的术语和定义适用于本文件。3. 1 回复突变reverse mutation 细菌由营养缺陷型回变到野生型。3.2 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验salmonella typhimurium reverse mutation assay 利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株，测定化学品引起沙门氏菌碱基置换或移码突变所诱发的组氨酸缺陷型(hi)回变到野生型(his+)的试验方法。4
8、 试验目的检测化学品的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。5 试验概述鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅有少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成野生型，因此能生长形成菌落，据此判断受试样品是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入外源性代谢活化系统，如鸟。1 GBZ/T 240. 8-2011 6 试验方法6. 1 受试样晶处理选定受试样品的合适溶剂，首选元菌水作为溶剂。如果不溶于水的或水溶性低的化学品，可选二甲基亚飘。6.2 剂量设计决定受试样品高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶
9、解度。自发回变数的减少，背景变得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少，都是毒性的标志。每一受试样品检翻时至少设五个剂量组，剂量设定范围为5g/皿5000g/皿，也可根据预试验结果按等比组距设定检测的剂量范围。6.3 试验方法6.3. 1 配制培养基和试剂6.3. 1. 1 20%葡萄糖嬉液称取200g葡萄糖，加入蒸馆水至1000 mL, 0.055 MPa高压灭菌20mino贮于40C冰箱。6.3.1.2 0.5 mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液成分D-生物素(相对分子质量244) 122 mg L组氨酸(相对分子质量155) 78 mg 元菌蒸馆水至1000mL 不宜进行高压灭
10、菌处理，使用元菌玻璃器皿配制。贮于4.C冰箱。6.3. 1.3 代谢活化系统大鼠肝微粒体晦S，其诱导和制备方法见附录A。6.3. 1.4 盐溶渣(1.65 mol/L KCI-O. 4 mol/L MgCh)成分氯化饵(KCD氧化镜(MgClz 6820) 蒸馆水0.103 MPa高压灭菌30mino贮于4.C冰箱。6.3.1.5 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)成分磷酸二氢铀(NaHzP04.2HzO) 磷酸氢二铀(NazHP04 12Hz 0) 蒸馆水0.103 MPa高压灭菌30mino贮于40C冰箱。6.3.1.6 O. 15 mol/L氧化饵溶液61. 5 g 40.7
11、g 至500mL 2.965 g 29.015 g 至500mL 称取氯化饵11.18 g，用蒸馆水稀释至1000mL ,O. 103 MPa高压灭菌30mino贮于4C冰箱。2 6.3. 1.7 氨节青霉素耐性溶液(8mg/mL) 称取氨节青霉素80mg，加入0.02mol/L NaOH溶液10mL。6. 3. 1. 8 O. 1 %结晶紫溶液称取结晶紫10mg，加10mL元菌水。6.3. 1. 9 四环素溶液(8mg/mL) 称取四环素40mg，加入o.02 mol/L HCl 溶液5mL。6.3. 1. 10 溶解或稀释化学物质常用蓓剂:蒸锚水、二甲基亚惆(DMSO)。6.3. 1. 1
12、1 常用阳性对照及参考剂量(参见GB15193. 4-2003): 柔毛霉素CPubescens)叠氮化铀(NaN3)2-氨基药(2卢FA)敌克松(dexon)丝裂霉素C(mytomycinC , MMC) 6.3. 1. 12 Vogel-Bonner(V-B)培养基E成分6.0g/皿1.5g/皿10g/皿L50g/皿o. 5g/皿拘橡酸(CSH8070HzO)100g 磷酸氢二饵(KzHP04) 500 g 磷酸氢氨铀(NaNH4HP04.4HzO)175 g 硫酸镜(MgS04.7HzO)10g 蒸馆水至1000mL GBZ/T 240. 8-20门先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫
13、酸镜缓缓倒入容量瓶中，加蒸锢水稀释至1000mL，分装后0.103MPa高压灭菌30mino贮于40C冰箱。6.3.1.13 顶层培养基成分琼脂粉1. 2g 氧化铀1. 0g 蒸锢水至2mL0.103 MPa高压灭菌20min后，加入0.5mmol/L组氨酸。.5mmol/L生物素溶液。6.3.1.14 底层培养基成分琼脂粉7.5 g 蒸馆水480 mL V-B培养基E10 mL 20%葡萄糖溶液10 mL 先将前两种成分于0.103MPa高压灭菌20min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿25mL30 mL倒平皿，冷凝固化后倒置于37.C培养箱中24h，备用。6.3. 1. 1
14、5 肉汤培养基成分牛肉昔膜陈2.5 g 5.0 g 3 GBZ/T 240.8-2011 磷酸氢二伺CK2HPO.)1. 0g 蒸懵水至500mL 将上述成分混合后，于0.103MPa高压灭菌30mino贮于40C冰箱。6.3. 1. 16 营养琼脂平板成分琼脂粉7.5 g 营养肉汤培养基500 mL 0.103 MPa高压灭菌20min后，倒斜面或平板。6.4 菌株一般使用鼠伤寒沙门氏菌TA97a或TA97、TA98、TA100、TA102菌株，需要时可选用TA1535、TA1537等菌株。6.4. 1 分离将新获得的或经长期保存的试验菌株分别划线接种于主平板，370C培养18h24 h。6
15、.4.2 增菌用接种环分别刮取主平板中分离好的单个菌落分别接种于5mL新鲜营养肉汤内增菌，370C振荡(100次/min)培养10h。该菌株培养物应每毫升不少于1X1092X109活菌数。6.4.3 保存取增菌液0.8mL，加高压灭菌DMSO0.07 mL置于2mL己灭菌、耐低温的带塞小塑料试管内，冷冻后贮存于盛有液氮的液氮罐内冷藏备用，置40C冰箱可保存一个月。6.4.4 菌株鉴定新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定，菌株鉴定的判断标准如表l所示。表1试验菌株鉴定的判断标准脂多糖氨韦青菌株组氨酸缺陷屏障缺损每素抗性切除修复缺损四环素抗性自发回变菌落数TA97 + +
16、+ + 90 180 TA98 + + 十+ 3050 TA100 + + + + 100200 TAI02 + 十+ 十240320 +表示+表示+表示+表示十表示祷在体外代谢活备注:需要组氨酸具有rfa突变具有R因子具有L:，.uvrB具有pAQI化条件下自发回变突变质粒菌落数略增注z其他菌株生物特性鉴定参照有关文献。6.4.4.1 组氨酸依赖性组氨酸营养缺陷型菌株只能在有组氨酸的营养培养基中生长，在不加组氨酸的培养基上则不生长。4 GBZ/T 240.8-20门将组氨酸营养缺陷型菌株分别用划线法接种子含有和不含有组氨酸的培养基中，37.C培养24h, 观察细菌生长情况。组氨酸缺陷型菌株在
17、含组氨酸平板上生长，而在元组氨酸平板上则不能生长或仅有少量增长。6.4.4.2 脂多糖屏障丢失具有深粗型突变(rfa)的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受影响。取0.1mL营养牛肉汤增菌液加到2mL 45 .C46.C己融化的顶层琼脂中，摇匀，立即倒在有营养肉汤的底层琼脂培养基上，使其均匀分布。待琼脂凝固后，在平皿中央放一直径为6mm的圆滤纸，然后将结晶紫水溶液(1mg/mL)10L滴在滤纸上。37.C培养24h.假若待测菌在滤纸片周围有清晰透明的抑菌圈，即表示结晶紫的分子己进入细菌体内，说明该待测菌株具有rfa突变
18、。6.4.4.3 紫外线损伤修复缺陆具有紫外线损伤修复缺陷(L:-，uvrB突变)的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。在营养牛肉汤琼脂培养基平皿的底部背面，用红笔划一直线，在培养基上沿红线用划线法接种细菌后，用黑纸覆盖平皿的1/2，其余部分用紫外线灯照射(15W)，距离33cm，照射8s。紫外线照射部分不能生长，而黑纸覆盖的那一半则能生长。具有.6.uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。6.4.4.4 抗氢韦青霉素R因子鉴定含R因子的试验菌株对氨韦青霉素有抗性。因为R因子不太稳定
19、，容易丢失，故用氨节青霉素确定该质粒存在与否。在营养牛肉汤琼脂平皿背面中线，用红笔划一直线，再用微量注射器在培养基上沿红线涂10L氨节青霉素，待其干后与红线垂直方向划线接种细菌，37.C培养24h。若待测菌在涂有氨节青霉素的部位生长，说明该菌具有抗氨韦青霉素作用，表示含有R因子，仍能生长。否则表示待测菌不含R因子或R因子丢失。6.4.4.5 抗四环素PAQl质粒鉴定含PAQ1质粒的试验菌株对四环素有抗性。因为PAQ1质粒不太稳定，容易丢失，故用四环素确定该质粒存在与否。在营养牛肉汤琼脂平皿背面中线，用红笔划一直线，再用微量注射器在培养基上沿红线涂10L四环素，待其干后与红线垂直方向划线接种细菌
20、，37.C培养24h。若待测菌在涂有四环素的部位生长，说明该菌具有抗四环素作用，表示含有PAQ1质粒，仍能生长。否则表示待测菌不含PAQ1质粒或PAQ1质粒丢失。6.4.4.6 自发回变每一种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变，称为自发回变。将待测菌株增菌液0.1mL加到2mL含组氨酸-生物素的顶层琼脂培养基的试管内，混匀后铺到底层琼脂平板上，待琼脂固化后，置37.C培养箱中孵育48h后记数每皿回变菌落数。每种标准测试菌株的自发回变菌落数应符合表2要求。经体外代谢活化后的自发回变菌落数，要比直接作用下的略高。5 GBZ/T 240. 8-2011 表2测试菌株的固变性诱变剂剂量S, TA97
21、 TA98 TA100 TA102 g/皿柔毛霉素6.0 124 3123 47 592 叠氮化纳1. 5 76 3 3000 188 ICR-191 1. 0 1640 63 185 。链霉黑素0.25 inh inh inh 2230 丝裂霉素C0.5 inh inh inh 2772 2，4，7-三硝基-9-药酣0.20 8377 8244 400 16 4硝基-0-次苯二胶20 2160 1599 798 。4硝基噎琳-N-氧化物0.5 528 292 4220 287 甲基磺酸甲醋1. 0 174 23 2730 6586 2-氨基药10 + 1742 6 194 3026 261
22、苯并(a)花1. 0 + 337 143 937 255 注:inh表示抑菌。表中数值均已扣除溶剂对照的回变菌落数;其他菌株对阳性物的反应参照有关文献。6.4.4.7 阳性对照物的回变菌落数6.5 试验方法一一平板掺入法6.5. 1 倒平板:先将底层培养基在45.C时倒平板，冷却凝固后放入37.C培养箱内24h.元菌落生长方可使用。6.5.2 接种:将含0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的顶层琼脂培养基2.0mL分装于试管中，45.C水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液0.1mL，受试样品溶液0.1mL和S9混合液0.5mL(需代谢活化时)，充分混匀，迅速倾入底层琼脂
23、平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后，倒置于37c培养箱里孵育48h.每受试样品检测皿加或不加S9混合液均作三个平行皿。6.5.3 对照z每一受试样品检测时必须设定阳性物对照，即将操作过程中加入受试样品溶液改换为阳性物，其他操作完全相同;同时，每批受试样品检测必须设定阴性对照，观察自发回变菌落数。操作过程中不加入受试样品，其余操作同本部分6.5.2。6.5.4 试验至少重复一次。7 数据处理与结果评价7. 1 数据处理记录受试样品各剂量组、空白对照组自发回变、溶剂对照组及阳性对照组的每皿回变菌落数，并求平均值和标准差。7.2 结果评价7.2.1 受试样品诱发的回变菌落数超过自发
24、回变菌落数2倍以上，并呈剂量-反应关系判定检测结果GBZ/T 240. 8-2011 为阳性。7.2.2 受试样品经四个试验菌株检测后，只要有一个试验菌株，无论在加Sg或不加Sg条件下为阳性者时，均可判定该受试样品Ames试验结果为阳性。7.2.3 四个试验菌株在加岛和不加Sg条件下均为阴性，且重复试验结果一致时，则可判定受试样品Ames试验结果为阴性。8 评价报告除GBZ/T240.1规定的一般项目外，评价报告还应包括以下内容zd 试验菌株;b) 代谢活化系统及所用诱导剂;c) 试验方法、操作步骤、受试样品检测剂量分组及阴性、阳性对照名称;d) 阳性结果评价原则以列表方式报告受试样品的Ame
25、s试验结果;e) 结论。9 结果解释阳性结果表明在本试验条件下受试样品具有致基因突变作用。阴性结果表明在本试验条件下受试样品不具有致基因突变作用。二ON|.O叮NHN白。GBZ/T 240.8-2011 附录A(资料性附录)大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备诱导应用最广泛的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯(Arodor1254)混合物，选择健康雄性大鼠体重200 g左右，一次腹腔注射诱导剂500mg/峙。诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mLo A.1 S9制备动物诱导后第5日断头处死。处死前12h停止饮食，但可自由饮水。首先，用75%酒精消毒动物皮肤，剖开腹部。在元菌条件下，取出肝脏，去除
26、肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15mol/L氯化饵淋洗肝脏，放入盛有0.15mol/L氯化饵溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.15mol/L氧化饵溶液3mL。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温(0.C4.C)高速离心机上，以9000g离心10min，取其上清液(Sg)组分分装于塑料管中。储存于液氮生物容器中或-80.C冰箱中备用。上述全部操作均在冰水浴中和元菌条件下进行。制备肝Sg所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。Sg置备后，其活力需经间接性诱变剂进行鉴定。A.2 侵权必究n一一兀巧，-nu9-nv ，-o口祷创一nu-号一价书一定版权专有GBZ/T 240.8-2011 打印H期:2011年11月23H F002
