1、HC/T 3645一1999前言本标准的制定.可改变我国生产企业胶乳及干胶制品中可水抽提蛋白质含量无试验方法的现状，为提高我国企业胶乳制品的测量水平及我国胶乳制品出口创汇打下坚实的基础。本标准由中华人民共和国原化学工业部技术监督司提出。本标准由全国橡标委胶乳制品分技术委员会归口。本标准主要起草单位:化工部株洲橡胶塑料工业研究设计院。本标准主要起草人:汤胜修、盛腊云、李枚辉。中华人民共和国化工行业标准天然橡胶手套中水抽提蛋白质测定方法Lowry法HG/T 3645一1999Method for the determination of aqueous extractable proteinin
2、natural rubber gloves using the Lowry method.告:使用本标准的人应该熟悉通常的实脸室操作。本标准不愈味.提出所有的安全问瓜，只涉及与本标准有关的安全问肠。位用者有资任谊立适当的安全和健康规范.并保证遵守目家的任何规定。本标准要求由具有实验室操作技能的并达到相当水平的分析工作者在装备了适当设备的实验室里进行。范围本标准提供了一个测定天然橡胶手套中水溶性蛋白质含量的方法。本标准也适合于其他橡胶制品中水溶性蛋白质含量的测定。2原理水溶性蛋白质可从缓冲溶液中抽提出来，然后沉淀提纯，把蛋白质从有可能干扰沉淀的水溶性物质中分离;再溶解提纯出来的蛋白质，用Lowr
3、y方法进行比色，测定蛋白质含量。3定义本标准采用下列定义。3. 1浓缩因子F Concentration factor被用来沉淀的蛋白质提抽液与用来再溶解蛋白质沉淀的溶液的体积比。例如:将4ml蛋白质提抽液进行沉淀，然后用1 ml.溶液再溶解沉淀，则浓缩因子F等于403. 2 Lowry对本标准来说，“Lowry“这个词用来表示原Lowry分析法的任何改进形式。3.3蛋白质protein本标准中提及的蛋白质是来自天然乳胶及其制品中的水溶性蛋白质和多肚。4仪器、设备4. 1离心机:性能至少为10 00oxg.离心管:容量为50m!和l Oml，对蛋白质吸附力小的聚丙烯管。4.2分光光度计和比色皿
4、。4.3旋涡混合器。4.4微量移液管、容量瓶4.5聚丙烯管:容量为50 ml一和10 ml，对蛋白质吸附力小的聚丙烯管。-一-一.一一-一一一一国家石油和化学工业局1999-08-12批准2000-10-01实施HG/T 3645一19995试荆5.1所用水均为重蒸馏水.所用试剂均为分析纯或相当纯度的试剂。5.2抽提试剂:0. 02mol/L,pH=7. 4的磷酸盐缓冲溶液。5.3改进的Lowry蛋白质试验试剂。5.3. 1试剂A:将10份试剂C和。.2份试剂D混匀，检验的当天配制。5.3.2试剂B:稀释的福林试剂(7.2份福林试剂十2.8份水)。5.3.3试剂C: 6g碳酸钠溶解在l oom
5、l一水中。5.3.4试剂D:1. 5g硫酸铜和3g柠檬酸钠溶解在looml水中。5.3.5氢氧化钠溶液:c(NaOH)=0. 2mol/l.,5.3.6脱氧胆酸钠(DOC) , o. 15 %(质量/体积),o. 15g脱氧胆酸钠溶解在looml水中。5.3.7三抓乙酸(TCA) : 72(质量/体积),72g三抓乙酸溶解在100mL水中。5.3.8确钨酸(PTA) : 72写(质量/体积),72g礴钨酸溶解在100mL水中5.3.9蛋白质母液:制备一个浓度为1 mg/mL的牛血清白蛋白标准蛋白质溶液，冷藏下，溶液能贮存48h,温度为一18C时，可贮存2个月;融化时，要求用水浴加热到45并保退
6、15min.注:冷藏时间为录计时间.为进免反复的冷冻和融化建议将蛋白质母液分几份贮存，每份足够制备一条标准曲线.或在试验步骤中足够使用。6测定步.6. 1蛋白质的抽提6.1.1在整个抽提过程中，应用pH =7.4的磷酸盐缓冲溶液作为抽提介质，其温度应保持在(25士;)C.6.1.2准确称取试样(4士0.5)g(精确到0.000 1g),剪成1cmX 4cm大小的片状，置于50ml聚丙烯管(.1.5)中，按试样量:抽提试剂体积小于等于1，10比例移取抽提试剂(5.2)于装有试片的聚丙烯管中，使被测试样全部均匀地浸泡在抽提试剂中，并保持在(25士5)0C，抽提2h，每间隔30min搅动试片6. 1
7、.3将抽提液倒人50 ml离心管中。在3 000 X g的条件下离心15min，小心注出上层清液，立即进人下步操作。否则必须将上层清液在2-C-8 C贮存，贮存时间不超过48h,6.2蛋白质标准溶液的制备用水稀释蛋白质母液(5. 3. 9 )，制备如下系列的蛋白质标准溶液:100 Jag/ml., 50 Jag/ml.,20 lag/ ml,10 Jag/ml.,5 pg/m1.,2 pg/mL,注:如果蛋白质母液在冷截下贮存，应注意冷藏下的累计时间不超过2天.6.3蛋白质的沉淀与浓编6.3.1在(25士5)0C，用三份平行样完成试验。6.3.2分别移取4ml，水空白)、标准蛋白质溶液(六个)
8、和手套抽提液(三个)分别置于l Oml聚丙烯离心管中，各加入。.4.L DOC(5. 3. 6)，用旋涡混合器混匀，室温条件下静置10min;然后各加人0. 4ml,丁CA(5. 3. 7 )，用旋涡混合器混匀，再分别加人0. 4 mL PTA (5. 3. 8)，用旋涡混合器混匀，在室温条件下静置30 min.6.3.3将离心管(6.3.2)在10 000 X g条件下离心30min。倾去上层清液，把离心管倒置在滤纸上，让水流千。6.3.4移取最小体积(根据固体沉淀的量可为1.OmL“4.0 ml,)的NaOH (5. 3. 5)到各离心管(6.3.3)中(包括空白)，用旋涡混合器混匀.再溶
9、解沉淀约20 min。在(3士I)条件下，重溶解蛋白质溶液可贮存48 h602HG/T 3645一1999It:若离心速度太低，可能不能充分分离蛋白质沉淀而导致错误结论6.4比色检验4.1分别移取。. 8 ml再溶解蛋白质溶液(包括空白)于聚丙烯管(4.5)中，各加人。. 3 ml.。试剂A3.1),混匀;加人。. 1 ml试剂B(5. 3. 2)，立即用旋涡混合器混匀，室温下静置30 min,6.吓6.4.2光度。注加人试刘B后1h内，移取1 m以6.4.D溶液到比色皿中，在750 nn波长处对照空白测定其吸取三份平行样测定值的平均值。在测定过程中，时间、仪器和波长的一致性对试验结果非常重要
10、.7结果裹示7. 1计算7.1.1标准曲线以蛋白质标准溶液的浓度与吸光度的对应关系制备标准曲线。蛋白质标准溶液浓度低于100 pg/ml时.标准曲线呈线性。7. 1.2浓度确定直接从标准曲线的线性部分确定样品的蛋白质浓度。7.2结果样品中蛋白质含量(pg/g)按下式计算:一一.一V,，、 可抽提蛋白质含量(pg/g)=孟 . *.，.“.”.，、式中:V-一抽提液的体积,ML;。从标准曲线上侧得的蛋白质浓度，pg/mL;F浓缩因子，F=4 mL/再溶解蛋白质沉淀所用NaOH的体积，mL;胡被抽提的手套质量，9.平行结果的极差不大于10 pg/g,8试脸报告试验报告至少包括下列内容:a.采用的标准;.被测定的样品名称;c.试验结果;d.试验日期;e.试验者。
