1、 ICS 65.020.30 B 41 备案号： 27471-2010 浙 江 省 地 方 标 准 DB33 DB33/T 780 2010(2013) 动物血吸虫病快速诊断技术规范 The norm for rapid diagnostic techniques of animal schistosomiasis 2010-03-17 发布 2010-04-17 实施 浙江省质量技术监督局 发布 DB33/T 780 2010(2013) I 前 言 本标准 的 附录 A和附录 B为资料性附录。 本标准由浙江省畜牧兽医标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：浙江省畜牧兽医局、浙江省农业
2、科学院。 本标准主要起草人：张雪娟、俞国乔、顾昀、卢福庄、陆国林、洪建伟、付媛、赵灵燕、石团员、倪柏锋。 DB33/T 780 2010(2013) 1 动物血吸虫病快速诊断技术规范 1 范围 本标准规定了动物血吸虫病金标免疫渗滤及三联斑点酶标诊断技术。 本标准适用于牛、羊、猪、兔等家畜血吸虫病的诊断、检疫、流行病学调查。锥虫病和肝片吸虫病也可参照三联斑点酶标诊断技术执行。 2 术语和定义 下 列术语和定义适用于本标准。 2.1 血吸虫病 schistosomiasis japonica 由血吸虫寄生于动物和人体内所引起的疾病。在我国特指日本血吸虫病，是由日本血吸虫（ Schistosoma
3、japoncum）寄生于哺乳动物和人所引起的疾病。 3 金标 免疫渗滤 诊断技术 3.1 材料 3.1.1 反应板。 3.1.2 封闭液（甲液）、金标抗原（乙液）、洗涤液（丙液）。 3.1.3 玻璃毛细管（内径 1 mm）。 3.1.4 阴、阳性标准血清。 3.1.5 待检血纸或血清（采集和保存参见附录 A）。 3.1.6 可调微量移液器及配套吸头。 3.1.7 塑料离心管（ 1.5 mL）或玻璃试管 (5 mL 10 mL)。 3.1.8 帐页纸打孔器 ( 0.55 cm)。 3.2 待检 样品 处理 3.2.1 取洁净塑料离心管或玻璃试管，编上相应的待检血纸或血清号。 3.2.2 标准阴、
4、阳血样处理：取标准阴、阳性血纸各 1 片 (0.24 cm2)，放入相应编号的塑料离心管或玻璃试管中，加入生理盐水 0.5 mL，室温浸泡 30 min，期间每隔 10 min 摇动 1 次，即成标准阴、阳性血纸浸出液。或标准阴、阳性血清冻干品，则每支冻干品中加入 0.8 mL 生理盐水溶解即可。 3.2.3 待检血样处理：用帐页纸打孔器裁取待检血纸 1 片 (0.24 cm2)，放入相应编号的塑料离心管或玻璃试管中，按 照 3.2.2 的方法制备待检血纸浸出液。或待检血清稀释：吸取生理盐水 0.79 mL 放入试管中，加入待检血清 0.01 mL，混合即可。 3.3 操作步骤 3.3.1 取
5、反应板 (板面有 5 个孔）编号，与待检血样编号对应。 3.3.2 用玻璃毛细管分别吸取标准阴、阳性血纸浸出液或 80 倍稀释的标准阴、阳性血清轻贴反应板孔中的硝酸纤维素膜 0.5 s(约 1 l)，点在反应板同 1 个孔中，两点边缘间距 2 mm。 3 min 4 min 后往小孔中加甲液 1 滴 (约 0.05 mL)；甲液渗入后，加乙液 1 滴 (约 0.05 mL)；待乙液渗入后，加丙液 1 滴 (约 0.05 mL)。如果点阳性血样处显红色斑点而点阴性血样处显黄色或浅粉红色斑点，说明该批试剂有效；否则说明该批试剂已失效。标准阴、阳性血样每天每批次只需做一次。 DB33/T 780 2
6、010(2013) 2 3.3.3 待检血样的点样参照 3.3.2，从反应板左边第 1 孔开始点样，到第 5 孔为止。一次可连续点样 35 块反应板。 3.3.4 先往点样最早的反应板第 1 孔加甲液 1 滴，间隔 5 s 10 s 再加第 2 孔，依次类推。血样点后 3 min 4 min 加甲液。 3.3.5 待甲液渗入后，每孔加乙液 1 滴。 3.3.6 待乙液渗入后，每孔加丙液 1 滴。 3.4 结果判定 10 min内判定结果，红色斑点判为阳性 (+)，浅粉红色或黄色斑 点判为阴性 (-)。 4 三联斑点酶标诊断技术 4.1 材料 4.1.1 三联酶标试剂 (含有联检膜和试剂 1 4
7、)。 4.1.2 待检血纸或血清（采集和保存见附录 A）。 4.1.3 可调微量移液器及 与之配套的吸头。 4.1.4 50 mL 烧杯。 4.1.5 5 mL 或 10 mL 试管。 4.1.6 10 mL 带刻度吸管。 4.1.7 100 mL 量筒。 4.1.8 帐页纸打孔机 ( 0.55 cm)。 4.1.9 直头眼科镊子。 4.1.10 吸水纸。 4.1.11 记号笔和铅笔。 4.1.12 蒸馏水。 4.2 待检样品处理 4.2.1 试剂 1 4 的配制参见附录 B。 4.2.2 编号：用记号笔在试管上，用铅笔在联检膜的未点抗原一侧分别编写对应的待检血样编号。然后用剪刀将联检膜条剪下
8、，放入相应号的试管中 ，每一试管加 1.5 mL 试剂 1。 4.2.3 标准阴、阳性血纸或血清的处理：吸取 1.5 mL 试剂 1 分别加到装有标准阴、阳性血纸（ 0.24 cm2/份）或标准阴、阳性血清 (0.004 mL)冻干品的青霉素瓶中，轻摇，每瓶加入联检膜 1 条。 4.2.4 加待检血样：用帐页纸打孔器裁取待检血纸 1 片（ 0.24 cm2）或用可调移液器吸取 0.004 mL 待检血清，放入含联检膜的相应编号的试管中，轻轻摇匀。 4.3 操作步骤 4.3.1 孵育：将加有待检样品或标准样品的试管轻摇片刻后，置 37 孵育 50 min 60 min，期间摇动试管 3 次。 4
9、.3.2 洗涤：用镊子将每支试管中膜夹出，放入盛有 40 mL 的试剂 1 的烧杯中，轻轻摇动洗涤 3 次，每次间隔 2 min。 4.3.3 加兔抗牛羊 IgG 抗血清 (试剂 2)反应：将洗涤好的膜用镊子夹出，放在吸水纸上吸去膜表面水分后，放入盛有 25 mL 试剂 2 的烧杯中，用镊子翻动膜，使其充分接触液体。然后，置 37 反应 50 min60 min，期间翻动膜 1 次。 4.3.4 洗涤：方法同 4.3.2 (若检测猪、兔血样，则 4.3.3， 4.3.4 两步省略 )。 4.3.5 加酶联葡萄球菌 A 蛋白溶液 (试剂 3)反应：用滤纸吸去膜表面水后，将膜放入盛有 25 mL
10、试剂 3 的烧杯 中，用镊子翻动膜，使膜浸在液体中。置 37 反应 40 min，期间翻动膜 1 次。 4.3.6 洗涤：方法同 4.3.2。 DB33/T 780 2010(2013) 3 4.3.7 加底物溶液 (试剂 4)显色反应：将已吸去表面水的膜放入盛有 40 mL 试剂 4 的烧杯中，轻轻摇动烧杯，待标准阳性血纸或血清与膜有清晰棕色斑点出现后终止反应 (1 min 20 min)。 4.3.8 终止反应：将烧杯中的反应 液弃去，用 蒸馏水 充分洗涤至水清为止 ,即可判定结果。 4.4 结果判定 目测判定结果，以膜编号端为右端，从左到右的圆斑依次为日本血吸虫病、伊氏锥虫病和肝片吸虫病
11、；某一圆斑显棕色或黄色判为阳性 (+)，浅黄色或无色 判为阴性 (-)。 DB33/T 780 2010(2013) 4 附 录 A （资料性附录） 待检血样的采集和保存 A.1 待检 血纸的采集和保存 A.1.1 采集 牛、猪、羊、兔 无菌采血 ，流出的血滴滴在已编号的洁净滤纸 条（ 1 cm5 cm） 另一端上，血纸吸血要均匀， 阴凉处 自然干燥后即成待检血纸。 A.1.2 保存 干燥后的待检血纸置塑料袋内密封 ，置 -20 保存。 A.2 待检血清的采集和保存 A.2.1 采集 牛、猪、羊、兔无菌采集静脉血，血液凝固析出血清后以 3000 rpm离心 10 min，吸出血清 。 A.2.
12、2 保存 待检血清分装在 1.5 mL 2.0 mL离心管中，置 -20 保存。 DB33/T 780 2010(2013) 5 附 录 B （资料性附录） 试剂 1 4 的配制 以下所有试剂均为分析纯试剂，水为符 合 GB/T 6682 规 定的二级水。 B.1 洗涤液 (试剂 1)的配制 取 NaCl 5 g， KCl 0.1 g， KH2PO4 0.1 g， Na2HPO4 0.6 g溶解在 500 mL生理盐水中，待试剂完全溶解后加入 2.5 mL吐温 -20，混匀即成试剂 1。用于血纸或血清、酶联葡萄球菌 A蛋白和兔抗牛羊 IgG抗血清或血纸的稀释液及三联酶标的洗涤液 。 B.2 兔
13、抗牛羊 IgG抗血清稀释液 (试剂 2)(兔抗牛羊 IgG抗血清 )的配制 将吸附有 0.080 mL 兔抗牛羊 IgG抗血清的自然干燥 滤纸片 (1cm1cm)或直接吸取 0.080 mL兔抗牛羊IgG抗血清加入装有 25 mL试剂 1的烧杯中摇匀后即成试剂 2。 B.3 酶联 SPA溶液 (试剂 3)的配制 吸取 5 mL试剂 1加到 冻干辣根过氧化物酶联葡萄球菌 A蛋白 (效价 1： 80)中，待溶解后倒入烧杯中，再量取 20 mL试剂 1，分 3次洗涤 冻干酶联葡萄球菌 A蛋白容器 ，合并倒入烧杯中，混匀即成试剂 3。 B.4 底物溶液 (试剂 4)的配制 取 NaCl 0.24 g， KCl 0.008 g， KH2PO4 0.008 g, Na2HPO4 0.04 g溶解在 40 mL生理盐水中，再加入3,3-二氨基联苯胺盐酸盐 20 mg，置 37 温箱避光溶解后即成试剂 4，临用前加 30%过氧化氢 40 l，使其最终浓度为 0.01%。
