1、 ICS 65.020 B 15 DB33 浙江省 地方标准 DB33/T 994 2015 西瓜品种枯萎病抗性评价技术规范 Technical specification for evaluating resistance of watermelon against fusarium wilt disease 2015 - 09 - 25 发布 2015 - 10 - 25 实施 浙江省质量技术监督局 发布 DB33/T 9942015 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则编写。 本标准由浙江省 农业厅提出。 本标准由浙江省种植业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位
2、：浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所、浙江省农药检定管理所。 本标准主要起草人：王汉荣、杨桂玲、王连平、方丽、陆剑飞、孙彩霞。 DB33/T 9942015 1 西瓜品种枯萎病抗性评价技术规范 1 范围 本 标准 规定了 西瓜品种枯萎 病抗 性评价技术的术语和定义、 鉴定方法 、 病情 调查与判定 。 本 标准 适用于 西瓜品种 枯萎病抗性鉴定和抗性评 定 。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本 文件 。 2.1 抗病性 disease resistance 植物所具有 的能够克服或减轻病原物致病作用的可遗传性状。 2.2 抗性评价 resista
3、nce evaluation 根据采用的技术标准判别植物对特定病害反应程度和抵抗水平的描述。 2.3 致病性 pathogenicity 病原物所具有的破坏寄主和引起病变的能力。 2.4 病情级别 disease rating 人为定量植物个体或群体发病程度的数值化描述。 2.5 病原分离物 pathogen isolate 采用人工方法从植物发病部位分离获得的、在特定环境条件下培养的病原物。 2.6 接种体 inoculum 用于接种以引起病害的病原物或病原物 的一部分。 DB33/T 9942015 2 2.7 接种液 inoculum suspension 用于接种的、含有接种体的悬浮液
4、。 2.8 发病率 rate of infected 发病西瓜 植株数 占总西瓜 植株数 的百分率。 2.9 病情指数 disease index (DI) 通过对植物个体发病程度（病情级别）数值的计算获得的群体发病程度的数值化描述形式，是描述发病严重度的综合指标。 3 鉴定方法 3.1 基本设备 恒温箱、超净工作台、高压灭菌锅、冰箱、可 控温的温室 （ 温度保持在 20 28） 、塑料 盆、铝锅、电炉、培养皿、试管、剪 刀 、 镊 子、广口瓶、酒精灯 、滤纸 、三角瓶、恒 温 振荡 箱培养等。 3.2 培养基制作 3.2.1 PDA 培养基 配方为马 铃薯 200 g、 葡萄糖 20 g、
5、琼脂 17 g，加蒸馏水至 1 000 ml。 按培养基配方称取去皮 马 铃薯 200 g， 切成小块放入锅中，加水 1 000 ml，在加热器上加热至沸腾，维持 30 min，用 2层纱布趁热在量杯上过滤，弃滤渣，取滤液补充水分到 1 000 ml； 把滤液放入锅中，加入葡萄糖 20 g，琼脂 17 g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻 璃 棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，再补充水分至 1 000 ml，调 pH值至 6.8 7.0。 将配制的培 养基分装入试管或 500 ml三角瓶内 ， 在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞或泡沫塑料塞后，再在塞 子 外包一层牛皮纸，用记号笔注明培养基名称、组别
6、、配制日期。试管 的 分装量为其 高度的 1/5，灭菌后制成斜面 ； 三角瓶 的 分装量以不超过其容积的一半为宜 ， 灭菌后 倒入灭菌培养皿，制成平板培养基。 3.2.2 PL 液体培养基 配方为马铃薯 200 g、乳糖 20 g、加蒸馏水至 1 000 ml。 按培养基配方称取去皮 马 铃薯 200 g， 切成小块放入锅中，加水 1 000 ml，在加热器上加热至沸腾，维持 30 min，用 2层纱布趁热在量杯上过滤，弃滤渣， 取滤液补充水分到 1 000 ml； 把滤液放入锅中，加入 乳糖 20 g，用玻 璃 棒搅拌后放在石棉网上，小火加热至沸腾，再补充水分至 1 000 ml。将配制的培
7、养基分装入 500 ml三角瓶内 ， 在三角烧瓶口上塞上棉塞或泡沫塑料塞后，再在塞 子 外包一层牛皮纸，用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期后 湿热灭菌。三角瓶 的 分装量以不超过其容积的一半为宜 。 3.2.3 绿豆液体培养基 DB33/T 9942015 3 配方为绿豆 40 g、氯化钠 8 g，加蒸馏水至 1 000 ml。 按培养基配方称取 绿豆 40 g， 放入锅中，加蒸馏 水 1 000 ml，在加热器上加热至沸腾，维持 30 min，用 2层纱布趁热在量杯上过滤，弃滤渣，取滤液补充水分到 1000 ml； 把滤液放入锅中，加入 氯化钠 8 g，用玻 璃 棒搅拌后放在石棉网上，小
8、火加热至沸腾，再补充水分至 1 000 ml。将配制的培养基分装入 500 ml三角瓶内 ， 在三角烧瓶口上塞上棉塞或泡沫塑料塞后，再在塞 子 外包一层牛皮纸，用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期后 湿热 灭菌。三角瓶 的 分装量以不超过其容积的一半为宜 。 3.3 病原物的准备 3.3.1 病原物分离与保存 取西瓜发病植株茎部病变的维管束组织，用常规组织分离法分离枯萎病病原物。分离物经形态学或分子生物学 鉴定以及在瓜类（西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、冬瓜、丝瓜、葫芦等）上的致病性测定确认为尖镰 孢菌西瓜 专化型 （ Fusarium oxysporum Sehl. f. sp. niveum (
9、E. F. Smith) Synder Hensen）后（参见附录 A），采用单孢分离进行纯化。 纯化后，将西瓜枯萎病菌接种于 PDA平板培养基上，并在接种点周围放置一定数量的灭菌滤纸片，在 25培养 7 d后，取出滤纸片，经真空干燥于 -20 -80的低温冰箱中保存。或将西瓜枯萎病菌接种于 PDA斜面养基上，在 25培养 7 d后， 置 4 8的冰箱中保存。 3.3.2 鉴定用枯萎病菌株 选择当地西瓜产区分离的 西瓜枯萎病菌 株，该菌应属于 分布 较 广 、致病力较强的 当地优势菌系。 3.3.3 接种体繁殖 将保存的鉴定接种用西瓜枯萎病菌移植于 PDA平板培养基上，在 25培养 7 d后，
10、在无菌操作下，接种于装有 PL液体培养基或 绿豆液体培养基 的三角瓶中（液体培养基的体积以三角瓶容量的 30% 35%为宜） ，置于 25恒 温 振荡 箱培养 中， 160 r /min 180 r /min 振荡 培养 5 d 7 d。 培养液经双层纱布过滤，滤液以 4000 r/min 离心 10 min，倒除上 清液，加适量的无菌水稀释，得到分生孢子悬浮液，供接种用。 3.4 接种液浓度、 鉴定 生育期及接种方法 用无菌水稀释上述供接种用的分生孢子悬浮液，镜检，将孢子悬浮液稀释至 4.0 106个 ml 配制成接种液。 采用苗期浸根接种鉴定。待穴盘中的西瓜苗长至子叶展平至真叶露尖时，小心
11、将苗起出，尽量避免伤根，抖去珍珠岩或黄沙，置于接种液中浸根 5 min，每份待 鉴定 的西瓜品种（系）接种 30株， 重复 3次 。接种后移栽于装有灭菌育苗基质、直径 10 cm营养钵中，置温室中并 及时覆膜保湿， 2 d后揭膜， 观察发病。 3.5 西瓜 鉴定 品种的 种植管理 将待 鉴定 的西瓜种子经 5%次氯酸钠溶液浸种 10 min后，用蒸馏水清洗 3次，再清水浸泡 5 h后，放入垫有两层湿润滤纸的培养皿中，置于恒温箱中，在 30 32恒温中催芽。为了保证植株间接种的一致性，挑选胚根长至 0.2 cm 0.3 cm的种子，一起播于装有灭菌珍珠岩或黄沙的育苗盘中，每个待鉴品种（系）各播一
12、盘。 DB33/T 9942015 4 接种后的西瓜苗，定植于装有灭菌育苗基质的直径 10 cm营养钵中（定植 播种前每 钵 先 用清 水 浇透），每钵 1株， 共 30株。置温室中观察发病， 温室温度 保持在 23 28之间。钵中育苗基质的湿度 保持在60% 80%为宜，早晚注意温度变化，防止温度过高和过低。 整个过程不使用杀菌剂。 3.6 感病对照 品种和 抗病对照 品种的确定 设置 一个感病对照和一个抗病对照，抗病对照选择 指 标为在常规接菌量下病情指数小于 20.00的品种 ； 感病对照选择 指 标为在常规接菌量下病情指数大于 80.00的品种。抗病对照 品种可缺省，但感病对照品种不得
13、缺省 ，感病对照选用本地区的常规感病品种。 4 病害 调查 与抗病性判定 4.1 病 害 调查 在 接 种后 第 15 d 逐株 调查各 鉴定 品种 （系） 西瓜 植株 枯萎病 的发病情况，记录病株数和病情级别。调查时间可根据感病对照品种病级扩展到最 高病级的时间作适当调整。 调查 病情分级 鉴定结果记录到鉴定结果原始记录表 （参 见附录 B） 。 4.2 调查分级标准 苗期西瓜枯萎病的主要症状为 叶片 先 自基部向 上 逐渐萎蔫，似缺水状 。初期 中午缺水萎蔫明显，早晚尚能恢复正常 ； 数日后，植株萎蔫不再恢复，慢慢枯死 。 多数情况全株发病，也有的病株仅部分茎蔓发病。发病植株茎蔓基部稍缢缩
14、，病部纵裂，有淡红色 至粉红色 胶状液溢出，根部腐烂变色，纵切根 茎 ，其维管束部分变褐色。 病情分级 采用 0级、 1级、 3级、 5级、 7级、 9级的 6级分级法，各病级分级标准 参见表 1。 表 1 西瓜植株枯萎病病级分级标准 病级 症状描述 0级 西瓜 植 株健康， 无病症。 1级 西瓜 植 株 茎上出现轻微病斑，但生长正常。 3级 西瓜 植 株 茎上病斑明显，生长轻微受抑制。 5级 西瓜 植 株 茎上病斑明显，植 株 顶端萎蔫，生长缓慢或僵化。 7级 西瓜 植 株 50%以下变褐枯萎。 9级 西瓜 植 株 50%以上变褐枯萎或枯死。 4.3 调查结果的统计 根据调查的结果计算各品种
15、的发病率和病情指数。 发病率以 “ Ri” 计，数值以 “ %” 表示，按式 (1)计算 ： Ri=（ ni/nt） 100 （ 1） 式中 ： ni 发病株数 ； nt 总株数。 计算结果精确到小数点后两位。 病情指数以 “DI”计，按式 (2)计算 ： DB33/T 9942015 5 DI= 9d t ccn n100 （ 2） 式中 ： dc相应病级 ； nc各病级病株数 ； nt总株数。 计算结果精确到小数点后两位。 4.4 鉴定结果的校正 由于鉴定的外界条件，包括地区间不可能完全一致，即使同一地区年度间、批次间鉴定结果也可能存在差异。为此，应对鉴定结果进行校正，即采用相对病情指数
16、进行校正。方法为 ： 鉴定中必须设感病对照 ，在 感病对照病情指数达 50.00以上时 进行发病调查 ， 由于 感病对照病情指数 不可能刚好为 50.00，为此，采用校正系数 K来进行校正， K值的求法 按式 （ 3） 计算 ： K=(50.00/DIck)100 （ 3） 式中 ： 50.00 感病对照 标准 病情指数 ； DIck 本次鉴定 感病对照病情指数 。 用 K值与本次鉴定中被鉴定品种的 病情指数 相乘，求得被鉴定品种的相对 病情指数 （ RDI）， RDI按式 （ 4） 计算 ： RDI=DI K （ 4） 式中 ： DI 被鉴定品种 病情指数 ； K 校正系数。 以 K值在 0
17、.75 1.25（相当于病情指数 66.67 40.00）之间的鉴定结果为准确可靠。 4.5 鉴定结果的 评定 根据被鉴定品种的 相对 病情指数 评定品种的抗性级别，各抗性级别评定标准参见表 2。 表 2 西瓜品种枯萎病抗性评定标准 序号 抗性类型 英文缩写 相对 病情指数 标准 1 高抗 HR 0 RDI 10.00 2 抗病 R 10.00 RDI 30.00 3 中抗 MR 30.00 RDI 50.00 4 中感 MS 50.00 RDI 60.00 5 感病 S 60.00 RDI 80.00 6 高感 HS 80.00 RDI 100.00 A DB33/T 9942015 6 A
18、 B 附 录 A （资料性附录） 西瓜枯萎病病原 A.1 学名 尖镰 孢西瓜 专化型 （ Fusarium oxysporum Sehl. f. sp. niveum (E. F. Smith) Synder Hensen）属真菌界 （ Fungi） ， 半知菌亚门 （ Deuteromycotina） ， 丝 孢 纲 （ Hyphomycetes）， 瘤座 孢 目（ Tuberculariales） ， 瘤座 孢 科 (Tuberculariaceae)， 镰 孢 属 （ Fusarium） ， 美丽组 （ elegans Wr.） ，尖 孢 种 （ oxysporum Schl.） 真菌。
19、 A.2 培养特性和孢子形态 A.2.1 特性 在 PDA培养基上，菌丝为白色，培养时间稍长培养基经常出现紫色，菌丝体透明，有分隔。 A.2.2 孢子 形态 A.2.2.1 大型分生孢子 大型分生 孢 子着生在复杂而又有分枝的分生 孢 子梗或瘤状的 孢 子座上，呈镰刀形至纺锤形，椭圆型弯曲基部有小柄，两端尖，顶端呈钩状，有的呈 喙 状弯曲，壁薄。通常具有 3个 5个分隔，以 3个分隔的常 见，大小为 （ 22.8m 38.4m）（ 2.6m 4.1m） ，黄褐色至橙色。 大型分生 孢 子通常有 3种培养型， 型为匀称镰刀形或纺锤形，顶细胞较长，足细胞明显或不明显，多为 3个分隔，属典型的尖 孢
20、 类型 ； 型较宽短或细长，多为 3个分隔，有的可多达 4个 5个分隔，有时可达 8个分隔 ； 型宽短，顶端呈钩状，有的呈 喙 状弯曲，上端 1/3处变宽，基部细胞逐渐变窄，足细胞有或不明显，多为 3个分隔，近于马特型。 A.2.2.2 小型分生孢子 多数为单胞，少数有 1个分隔，通常为卵形，有时为椭圆形、倒卵形、肾形、柱形，大小为（ 5m 12m）（ 2.2m 3.5m） ，通常着生于菌丝侧面的分生 孢 子梗，聚集成假头状。 A.2.2.3 厚垣孢子 通常单生，有时双生，多数在老熟的菌丝顶端和 中 间形成，有时亦可生于大型分生 孢 子上，表面光滑，偶有粗糙，球形至卵圆形，浅黄至黄褐色。 DB33/T 9942015 7 B C 附 录 B （资料性附录） 鉴定结果原始记录表 表 B.1 给出了西瓜品种枯萎病抗性鉴定结果原始记录表 表 B.1 西瓜品种枯萎病抗性鉴定结果原始记录表 品种名称 总株数 0级 株数 1级 株数 3级 株数 5级 株数 7级 株数 9级 株数 发病率 /% 病情指数 相对 病情指数 鉴定地点： 接种生育期： 接种病原菌编号： 播种日期： 年 月 日 接种日期： 年 月 日 调查日期： 年 月 日 鉴定人： 校核人： 审核人： 年 月 日 年 月 日 年 月 日 _
