1、ICS 65.020.30B41DB41河南省地方标 准DB41/T 15252018猪圆环病毒 型实时荧光 PCR 检测方法2018 - 01 - 03 发布 2018 - 04 - 03 实施河南省质量技术监督局发布DB41/T 15252018I前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出。本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，驻马店市动物疫病预防控制中心，平顶山市动物疫病预防控制中心，商丘市动物疫病预防控制中心，国家食品药品监管总局。本标准主要起草人：班付国、闫若潜、王翠、谢彩华、王淑娟、王东方、朱前磊。本标准参加起草人：赵雪丽、王华俊、孙素芳
2、、郭育培、陶顺启、刘敏、苑述友、苗连叶、杨海波、王李辉、王一、王磊、钱勇。DB41/T 152520181猪圆环病毒 型实时荧光 PCR 检测方法1范围本标准规定了猪圆环病毒型（PCV2）实时荧光 PCR 检测的试剂和仪器设备，样品采集、处理、存放及运输，操作方法及结果判定。本标准适用于对疑似PCV2感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、淋巴结及扁桃体等组织样品及血液样品中病毒核酸的检测。2 试剂和仪器设备除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。水为灭菌双蒸水或超纯水。2.1 试剂2.1.1 组织悬液、消化液、TE 缓冲液（见附录 A），以上试剂常温保存。2.1.2 酚/氯仿/异戊醇混合液(25
3、:24:1)、0.01 mol/L（pH 7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）、1 核酸电泳缓冲液、阿氏液（见附录 A），以上试剂 4保存。2.1.3 消化液、阳性对照、阴性对照（见附录 A），置-20 保存。2.1.4 PCV2 实时荧光 PCR 检测用上、下游引物及探针序列参见附录 B。2.2 仪器设备实时荧光定量PCR仪，高速冷冻离心机（12 000g以上），二级生物安全柜，恒温水浴锅，2 8 冰箱，70 冰箱，组织匀浆器或研钵，单道微量移液器（0.1 L0.25 L；0.5 L10 L；2L20 L；20 L200 L ；100 L1 000 L），真空干燥器（非必备）。3 样品的采集、处
4、理、存放及运输3.1 样品的采集及处理采集疑似 PCV2 感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、淋巴结及扁桃体等靶组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品约 0.5 g 于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入 0.3 mL0.5 mL 组织悬液混匀，然后将悬液转入无菌 Eppendorf 管中，4条件下 5 000 r/min 离心 10 min，取上清转入新的无菌 Eppendorf 管中，编号备用。3.2 血清和抗凝血用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉采集血液3 mL5 mL，待血清析出后直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用；用无菌注射器先吸入抗凝剂（阿氏液）2 mL3 mL，再自
5、耳缘静脉或前腔静脉采集等量血液，快速混匀后转入无菌Eppendorf管中，编号备用。3.3 存放与运送DB41/T 152520182采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。样品在 2 8 条件下保存应不超过 24 h；若超过 24 h，应放置低于-20冰箱，不宜反复冻融。4 操作方法4.1 样品 DNA 的提取4.1.1 取 1.5 mL 无菌离心管，于各管中分别加入待测样品、阴性对照、阳性对照各 100 L，再加入500 L 消化液和 10 L 消化液， 吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）； 置 55 水浴 30 min1h。4.1.2 分别加入 500 L
6、酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，于 4 条件下 12000 r/min 离心 10 min。4.1.3 分别吸取离心后的上清液转移至新的 1.5 mL 无菌离心管中（注意不要碰到中间层），加入等体积-20 预冷的异丙醇，混匀，室温放置 15 min。4.1.4 4 条件下 12 000 r/min 离心 15 min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，将无菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体；不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。加入700 L 75 %乙醇，轻轻混匀。4.1.5 4 条件下 12 000 r/min 离心 5 min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒
7、去上清液，将无菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体；不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。4.1.6 4 条件下 12 000 r/min 离心 30 s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不应触及沉淀，真空抽干 3 min5 min 或室温干燥 10 min。4.1.7 加入 10 L TE 缓冲液，轻轻混匀，溶解 DNA，2 000 r/min 离心 5 s，置-20 冻存备用。4.1.8 DNA 的制备可采用 4.1.14.1.7 提取方法，也可采用商品化的试剂盒提取。4.2 实时荧光 PCR 扩增4.2.1 实时荧光 PCR 反应混合液组成：
8、10PCR 缓冲液(含 Mg2+)，2.5 L；2.5mM dNTPs，2 L；PCV2FQ-F，0.5 L；PCV2 FQ-R，0.5 L；PCV2 -Probe，1.0 L；Taq DNA 聚合酶，0.25 L ；水，1 4.25 L；总体积为 21 L。4.2.2 在检测区配制与 4.1 中相同数量的实时荧光 PCR 反应体系，向每个实时荧光 PCR 反应管中加入4.1 中相应 DNA 4 L，充分混匀，使液体全部聚集于管底，按照加样顺序摆放好实时荧光 PCR 反应管。4.2.3 将 4.2.1 中加样后的实时荧光 PCR 反应管放入实时荧光定量 PCR 仪内并记录样本摆放顺序。4.2.
9、4 反应参数设置： 95 预变性 4 min，94 15 s，60 40 s，共 40 个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号收集，荧光模式设为 FAM/NONE 标记模式。5 结果判定5.1 结果分析条件设定阈值设定以阴性对照扩增曲线的最高点为原则，读取检测结果。5.2 质量控制标准阴性对照的检测结果应无特定扩增曲线，且C t值32.0或无；阳性对照的C t值应29.0，且出现特定扩增曲线（参见附录C）。5.3 结果描述及判定DB41/T 1525201835.3.1 阳性在质量控制标准成立的前提下， 样品 Ct 值29.0， 且出现特定扩增曲线，则判定为 PCV2 核酸阳性。5.3.2
10、 阴性在质量控制标准成立的前提下，样品 Ct 值32.0 或无，且无特定扩增曲线，判定为 PCV2 核酸阴性。5.3.3 可疑在质量控制标准成立的前提下，样品 29.0Ct 值32.0，且有特定的扩增曲线，判定为可疑；可疑样品应重新检测，结果为阳性者判定为 PCV2 核酸阳性，否则判定为 PCV2 核酸阴性。DB41/T 152520184AA附录A（规范性附录）试剂的配制A.1 组织悬液在0.01 mol/L PBS液中添加青霉素(2 000 IU/mL)，链霉素(2 mg/mL)、庆大霉素(50 pg/mL)和制霉菌素(1 000 IU/m L)。A.2 消化液Tris-HCl（pH 8.
11、0）终浓度 10 mmol/L；EDTA（pH 8.0）终浓度 25 mmol/L；SDS（w/v）终浓度 0. 5%；NaCl 终浓度 100 mmol/L。A.3 TE缓冲液Tris-HCl (pH 8.0)终浓度为 10 mol/L，EDTA (pH 8.0) 终浓度为 1 mol/L。A.4 酚 /氯仿/ 异戊醇溶液Tris饱和酚：氯仿：异戊醇按25:24:1的比例混合。A.5 阿氏液葡萄糖2.05 g，柠檬酸钠0.8 g，柠檬酸0.055 g，氯化钠0.42 g，加蒸馏水至100 mL，溶解后调pH值至6.1，121 高压灭菌15 min，4保存备用。A.6 0.01 mol/L（p
12、H 7.2 ）的磷酸盐缓冲液（PBS ）A.6.1 A液（0.2 mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4H2O 27.6 g，用适量蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。A.6.2 B液（0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO412H2O 71.6 g，用适量蒸馏水溶解，定容至1 000mL。A.6.3 0.01 mol/L PBS的配制：A液14 mL，B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL；121 高压灭菌15 min，4 保存备用。A.7 消化液称取100 mg蛋白酶K溶解于5 mL灭菌水中。A.8 1核酸电泳缓冲液DB41/T 15252
13、0185Tris碱，24.2 g；冰乙酸，5.71 mL；0.5 mol/L EDTA(pH8.0)，10mL；加去离子水定容至 100 mL，使用时用去离子水作 50 倍稀释，即为 1核酸电泳缓冲液。A.9 阳性对照经PK-15 细胞培养纯化、灭活的PCV2 细胞毒。A.10 阴性对照PK-15 细胞培养物。DB41/T 152520186BB附录B（资料性附录）猪圆环病毒型实时荧光 PCR 检测方法所用引物及探针猪圆环病毒型实时荧光 PCR 检测方法所用引物及探针见表 B.1。表 B.1 猪圆环病毒 型实时荧光 PCR 检测方法所用引物及探针序列引物名称 引物浓度/(pmol/L)引物序列PCR扩增上游引物（PCV2 FQ-F）20 5- TTTGGCCCGCAGTATTCTG -3PCR扩增下游引物（PCV2 FQ-R）20 5- CTGGGACAGCAGTTGAGGAGTA -3PCR扩增探针（PCV2-Probe）100 5-FAM- TTACCAGCAATCAGACCCCGTTGGA-TAMRA-3DB41/T 152520187CCD附录C（资料性附录）PCV2 实时荧光 PCR 检测方法扩增图PCV2 实时荧光 PCR 检测方法的扩增图见图 C.1。注：P：PCV2阳性对照；N：阴性对照图 C.1 PCV2 实时荧光 PCR 检测方法扩增图_
