1、 DB41 河南省地方标准 DB 41/T 706 2011 猪传染性胃肠炎病毒与流行性腹泻病毒二重 RT-PCR 鉴别诊断试验方法 2011 - 12 - 20 发布 2011 - 12 - 20 实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 706 2011 I 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河南省畜牧局 提出并归口。 本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心。 本标准起草人：吴志明、张志凌、闫若潜、赵明军、谢彩华、赵雪丽、刘梅芬。 DB41/T 706 2011 1 猪传染性胃肠炎病毒与流行性腹泻病毒二重 RT-PCR鉴别 诊断试验方法 1 范
2、围 本标准规定了猪传染性胃肠炎 病毒 和流行性腹泻病毒二重 RT-PCR试验的样品采集、处理、存放 及 运输、操作方法及结果判定。 本标准适用于对疑似 感染 猪传染性胃肠炎 病毒 和 流行性腹泻病毒 的 猪肠组织、胃肠道粘膜、肠内容物或粪便等样品中 病毒核酸进行检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 二重反转录聚合酶链式反应 (二重 RT-PCR) 二重RT -PCR是在同一反转录体系内加入 两 条分别针对 二 种病毒 相应基因序列的反转录引物进行反转录，在同一PCR 反应混合液中加 入 两对分别针对 二种病毒 相应基因序列的特异性引物进行 PCR扩增，通过一次 PCR反
3、应，可同时扩增出 二种 病毒相应核酸 片段 的 RT-PCR反应。 3 试剂和仪器设备 3.1 试剂 3.1.1 除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。提取 RNA 所用试剂均应使用无 RNA 酶的容器进行分装 。 3.1.2 组织悬液、 粪便 及 肛门拭子悬液 （见附录 A） 常温保存。 3.1.3 裂解液（TriZol ） 、 氯仿，1 核酸电泳缓冲液 、 0.01 molL -1（ pH 7.2）的 PBS、 焦碳酸二乙酯 （ DEPC）处理 水 （见附录 A） 2 8 保存 。 3.1.4 异丙醇，75 %乙醇 、 DNA 分子量标准 、 6 电泳上样缓冲液 均 15 以下 保存。 3
4、.1.5 阳性对照样品、阴性对照样品 见附录 A。 3.1.6 RT-PCR 扩增用上、下游引物序列参见附录 B。 3.1.7 猪传染性胃肠炎 病毒 和流行性腹泻病毒二重 RT-PCR 反应混合液组成、说明及使用注意事项参见附录 C。 3.2 仪器设备 PCR扩增仪，高速冷冻离心机（离心力应在 12 000g以上 ），电泳仪和水平电泳槽，恒温水浴锅，DB41/T 706 2011 2 2 8 冰箱， 20冰箱，单道微量移液器（0.5 L 10 L； 2 L 20 L； 20 L 200 L； 100 L1 000 L）， 组织匀浆器或研 钵， 凝胶成像系统 (或紫外透射仪 )。 4 样品的采集
5、、处理、存放及运输 4.1 样品的采集及处理 4.1.1 组织样品 用无菌的剪刀剪取猪小肠组织 0.5 g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，或用刀片刮取病死猪胃肠道粘膜放入 无菌 1.5 mL离心 管中，加 0.3 mL0.5 mL 组织悬液 混匀，将组织悬液转入无菌 1.5 mL离心 管中， 4 条件下5 000 rmin -1离心 10 min，取上清转入新的无菌1.5 mL 离心 管中，编号备用。 4.1.2 肠内容物样品 无菌取小肠内容物样品 3g，置于无菌离心管中，加 0.5 mL 1.0 mL 肠内容物悬液 混匀， 4 条件下 5 000 rmin -1离心 10 min，取上清
6、转入新的无菌 1.5 mL离心 管中，编号备用。 4.1.3 肛门拭子样品 将棉拭子深入猪肛门内 2 cm 3 cm轻轻旋转 3 5圈，放入盛有 1.0 mL拭子 悬液的 1.5 mL离心 管中，然后将拭子悬液转入无菌 1.5 mL离心 管中，4 条件下 5 000 r min-1离心 10 min，取上清转入新的无菌1.5 mL离心 管中，编号备用。 4.2 存放与运送 采集或处理的样品在 2 8 条件下保存应不超过24 h ， 密封后， 冷藏保 存，及时 运送到实验室 。若需长期保存， 应放置于 40 以下处冷冻保存 ， 应避免反复冻融。 5 操作方法 5.1 样品 RNA 的制备 5.1
7、.1 取 1.5 mL 灭菌 离心 管，每管加入 300 L 裂解液， 分别加入待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品各 100 L，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；再加入 100 L 氯仿，充分颠倒混匀（不宜过于强烈）；于 4 条件下， 12 000 rmin -1离心 15 min。 5.1.2 吸取离心后各管中的上清液 150 L 转移至新的 1.5 mL 灭菌 离心管中（ 不要吸出中间层），加入 150 L 20 预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置 15 min。 5.1.3 4条件下 12 000 rmin -1离心 15 min（ 离心 管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻
8、倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应置于吸水纸不同地方沾干。加入 1 mL 75%乙醇，轻轻颠倒洗涤。 DB41/T 706 2011 3 5.1.4 4 条件下 12 000 rmin -1离心 5 min（ 离心 管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。 5.1.5 4 条件下 12 000 rmin -1离心 30 s，将管壁上的残余液体甩到管底部 ，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面， 真空抽干 3 min 5 min 或 室温干燥 10 min。 5.1.6 加入 21
9、L DEPC 处理 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA， 2 000 rmin -1离心 5 s，冰上保存备用。提取的 RNA 须在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增或放置于70 冰箱备用。 5.2 反转录（ cDNA 的合成） 配制反转录反应混合液（反转录反应混合液组成参见附录 C.2.1），向每管中分别加入 5.1.6中相应 RNA 10L，并对每个管进行相应的编号， 37 水浴 1h或置于PCR 仪中 37 1h，反应结束后， 70 15 min 灭活反转录酶，直接用于下面的 PCR扩增或20 冻存备用。 5.3 二重 PCR 扩增 配制PCR 反应混合液（ PCR反应混合液组成参见附
10、录 C.2.2） ，在室温下融化后，瞬时离心使液体全部聚集在管底部 ， 向每管中加入 5.2 中相应 cDNA 的 4L， 经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底，加入 25 L的石蜡油覆盖液面（若 PCR仪具有热盖加热功能时 PCR反应管中也可不加石蜡油），并对每个管进行相应的编号。 PCR扩增条件： 95 预变性5 min 后， 94 45 s， 51 45 s ， 72 45 s 共 35个循环，最后72延伸 10 min。扩增反应结束后取出放置于 2 8 。 5.4 PCR 扩增产物的电泳检测 称取 1.2 g 琼脂搪加入 100 mL核酸电泳缓冲液中， 加热 充分溶化后稍放凉，加入
11、适量的溴化乙锭( 终浓度 0.5 g mL-1)，倒入胶槽制备凝胶板。在电泳槽中加入核酸电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取 5 L 10 L PCR扩增产物分别和 1 L 2 L 的 6 上样缓冲液混合后 ，分别加样到凝胶孔。 5 V/cm恒压下电泳 30 min。将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果，进行判定并做好试验记录。 6 结果判定 6.1 试验结果成立条件 猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒阳性对照的 PCR产物，经电泳后在 869bp和 448bp位置同时出现特异性条带，同时阴性对照 PCR产物电泳后没有任何条带，则检测试验结果成立，否则结果不成立（参见附录 D）。 6
12、.2 阳性判定 DB41/T 706 2011 4 在试验结果成立的前提下，如果待检样品的PCR产物电泳后在869bp和448bp 的位置上同时出现特 异性条带，判定为 猪传染性胃肠炎和流行性腹 泻病毒 核酸检测双阳性；若 869bp位置出现特异条带而 448bp位置无特异条带，判 定为猪传染性胃肠炎 病毒 核酸 检测 阳性； 若 448bp位置出现特异条带而 869bp位置无特异条带，判 定为猪流行性腹泻病毒核酸 检测 阳性 （参见附录 D） 。 6.3 阴性判定 在试验结果成立的前提下，待检样品的 PCR产物电泳后在869bp 和 448bp位置均未出现特异性条带，判定为 猪传染性胃肠炎和
13、流行性腹泻病毒 核酸检测阴性（参见附录 D）。 DB41/T 706 2011 5 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 组织 、肠内容物 悬液：在 0.01 molL -1 PBS液中添加青霉素 (2 000 IU mL-1)，链霉素 (2 mgmL -1)、庆大霉素 (50 pg mL-1)和制霉菌素 (1 000 IU mL-1)。 A.2 拭子悬液：在 0.01 mol L-1 PBS液中添加组织悬液所有的抗生素，浓度提高 5 倍；加入抗生素后调 pH值至 7.2 7.4。 A.3 1核酸电泳缓冲液： Tris碱， 24.2 g；冰乙酸， 5.71 mL； 0.5 mol L
14、-1 EDTA(pH8.0)， 10 mL；加去离子水定容至 100 mL，使用时用去离子水作 50 倍稀释，即为 1 核酸电泳缓冲液。 A.4 0.01 mol L-1（ pH 7.2）的 磷 酸盐缓冲液（ PBS） 的配制： a) A液（ 0.2 mol L-1磷酸二氢钠水溶液）： NaH2PO4H 2O 27.6 g，先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释并定容至 1000 mL。 b) B液（ 0.2 mol L-1磷酸氢二钠水溶液 ）： Na2HPO47H 2O 53.6 g，（或 Na2HPO412H 2O 71.6 g或Na2HPO42H 2O 35.6 g）先用适量蒸馏水溶解，最
15、后用蒸馏水稀释并定容至 1000 mL。 c) 0.01 molL -1 PBS的配制：A 液 14 mL， B液 36 mL，加 NaCl 8.5 g，最后用蒸馏水稀释并定容至1 000 mL； 121，15 min 高压灭菌， 4 保存备用。 A.5 DEPC处理水：用 0.1 %DEPC处理后的蒸馏水，经 121 15 min 高压处理，用于溶解 RNA。 A.6 阳性对照 样品 ：经灭活的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒细胞培养毒。 A.7 阴性对照 样品 ：正常细胞培养液。 DB41/T 706 2011 6 A A 附 录 B （资料性附录） 猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒 二重
16、RT-PCR 试验所用引物 猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT -PCR试验所用引物 见表 B.1。 表 B.1 猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒 二重 RT-PCR 试验所用引物 引物名称 引物浓度 引 物 序 列 PCR扩增上游引物TGEV-P1 20 molL-1 5-TCATTCTTCAACCCCATAAC-3 PCR扩增下游引物TGEV-P2 20 molL-1 5-AAGGAATTGTCCAGTCTTAG-3 PCR扩增上游引物PEDV-P1 20 molL-1 5- CTGCGTTCTTGTATGGTG T-3 PCR扩增下游引物PEDV-P2 20 molL-1 5-TGAA
17、GCATTGACTGAACGAC-3 DB41/T 706 2011 7 B B 附 录 C （资料性附录） 猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒 二重 RT-PCR 试验反应混合液组成、说明 C.1 猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT -PCR试验反应混合液组成 猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT -PCR试验反应混合液组成 见表 C.1。 表 C.1 猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重 RT-PCR试验反应混合液组成 C.2 说明 C.2.1 反转录反应混合液成份含： M-MLV 5Reaction buffer( 含 Mg2+)， 4L； 2.5mM dNTPs， 4 L； M-MLV
18、，0.5 L； RNA酶抑制剂， 0.5 L； 反转录引物（TGEV- P2 0.5 L， PEDV-P2 0.5 L） 1L；总体 积 10 L 。 C.2.2 二重 PCR反应混合液成分： 10PCR缓冲液 (含 Mg2+)， 2.5 L； 2.5mM dNTPs， 2 L； TGEV-P1， 0.5 L； TGEV-P2， 0.5 L； PEDV-P1， 0.5 L； PEDV-P2， 0.5 L； Taq DNA聚合酶， 0.25 L ；水， 14.25 L；总体积为 21 L。 C.2.3 裂解液的主要成分是 TriZol，为 RNA提取试剂，外观为粉红色，于 4 保存。 C.2.4
19、 DEPC水，用0.1 %DEPC 处理后的去离子水，经 121 15 min高压处理， 用于溶解RNA。 C.2.5 反转录反应混合液中分别含猪传染性胃肠炎或流行性腹泻病毒反转录引物、反转录酶及各种离组成成分 数 量 反转录反应混合液 20 管 (10L/管 ) PCR 反应混合液 20 管 (21L/管 ） 阳性对照样品 1 mL 阴性对照样品 1 mL 裂解 液 6.5 mL 氯仿 5.0 mL 异丙醇 10 mL 75%乙醇 20 mL DEPC 水 1.4 mL 50 倍 TAE 电泳缓冲液 40 mL 溴化乙锭溶液 40 L 上样缓冲液 150 L 石蜡油 2 mL DB41/T
20、706 2011 8 子。 C.2.6 PCR反应混合液中含猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒特异性引物对、 Taq酶及各种离子。 DB41/T 706 2011 9 C C 附 录 D （资料性附录） 猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重 RT-PCR 产物电泳图 猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重 RT-PCR产物电泳图见图 D.1。 注： M.DL2000 Marker； 1. TGEV 与 PEDV 双 阳性； 2. PEDV 阳性对照； 3. TGEV 阳性对照； 4. 阴性对照 图 D.1 猪传染性胃肠炎病毒与流行性腹泻病毒二重 RT-PCR 产物电泳图 _ M 1 2 3 4 1000bp 750bp 500bp
