1、 DB41 河南省地方标准 DB 41/T 780 2013 纤维乙醇用木聚糖酶制剂 2013 - 01 - 28 发布 2013 - 03 - 28 实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 780 2013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河南省质量技术监督局提出。 本标准由河南天冠纤维乙醇有限公司、南阳市质量技术监督检验测 试中心起草。 本标准主要起草人：王林风、闫德冉、阎振丽、杨付伟、任建伟、刘小菊、郭敬东。 DB41/T 780 2013 1 纤维乙醇用木聚糖酶制剂 1 范围 本标准规定了纤维乙醇用木聚糖酶制剂的术语和定义、要求、试验
2、方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存。 本标准适用于由黑曲霉或里氏木霉通过经液态或固态发酵后制得的 木聚糖酶制剂 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 191 包装储运图示标志 GB/T 6678 化工产品采样总则 GB/T 6679 固体化工产品采样通则 GB/T 6680 液体化工产品采样通则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 QB/T 1803 工业酶制剂通用试验方法 QB/T 1804 工业酶制剂通用检验规则和标志、
3、包装、运输、贮存 定量包装商品计量监督管理办法 国家质量技术监督检验检疫总局令 2005第 75号 3 术语和 定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 木聚糖酶 在各种酶组分的协同作用下，能够专一 降解木聚糖，使之转变为木寡糖、 D-木糖的酶。 3.2 酶活力 在（50 1） 、 pH4.8条件下，每分钟分解底 物木聚糖生成相当于 1mol木糖的还原糖 的酶 量 ， 定义为一个酶活力单位 ，以 U表示 。 4 要求 4.1 外观 4.1.1 液体剂型：透明液体， 棕色或浅黄色，无异味，允许有少量凝聚物。 4.1.2 固体剂 型 ：棕黄色颗粒状或粉状 ，无异味。 DB41/T 780 201
4、3 2 4.2 理化要求 应符合表 1的规定。 表 1 项目 液体酶制剂 固体酶制剂 酶活力 2500 U/mL 10000 U/g 干燥失重 8.0% 细度（ 40 目标准筛通过率） 80% pH 值（ 25） 4.0 6.0 4.3 净含量及允许短缺量 净含量及允许短缺量见表 2。 表 2 净含量 g或 mL 允许短缺量 g或 mL 5000 75 25000 250 50000 500 5 试验方法 5.1 外观 5.1.1 液体剂型：按 GB/T 6680 规定的采样方法，取 10mL 样品于 15mm150mm 试管中，目测鼻嗅。 5.1.2 固体剂型：按 GB/T 6679 规定的
5、采样方法，取 10g 样品，目测鼻嗅。 5.2 理化要求 5.2.1 酶活力 按附录 A规定的方法进行 。 5.2.2 干燥失重 按 QB/T 1803规定的方法进行。 5.2.3 细度 按 QB/T 1803规定的方法进行。 5.2.4 pH 值 按 QB/T 1803规 定的方法进行 。 DB41/T 780 2013 3 5.3 净含量及允许短缺量 按定量包装商品计量监督管理办法的规定进行。 6 检验规则和标志、包装、运输、贮存 6.1 采样 按GB/T 6678 、 GB/T 6680、 GB/T 6679的规定进行，将样品充分混匀后，分装于两个干燥清洁带有磨口塞的玻璃瓶中。一瓶作为检
6、验分析用，一瓶保留 1个月，以备查验。 6.2 检验规则和标志、包装、运输、贮存 应符合 QB/T 1804的规定 。 6.3 包装储运图示标志 按GB/T 191的规定执行。 6.4 保质期 6.5 在 25 以下，固体酶制剂保质期 180d，保质期内酶活力应不低于标示的酶活力的 85%。 6.6 在 25 以下，液体酶制剂保质期 90d，保质期内酶活力应不低于标示的酶活力的 85%。 DB41/T 780 2013 4 A A 附 录 A （规范性附录） 木聚糖酶活力的测定方法 A.1 原理 木聚糖酶在一定温度和 pH条件下，能将底物木聚糖降解为 木 寡糖和 D-木糖。还原性寡糖和单糖在沸
7、水浴条件下可与 3,5-二硝基水杨酸 (DNS)试剂发生显色反应，其颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中的木聚糖酶含量成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的深浅，可以计算出反应液中木聚糖酶的活力。 A.2 试剂和溶液 A.2.1 试剂和 水 除 非另有说明，所用试剂均为分析纯，水均为符合 GB/T 6682中规定的二级水。 A.2.2 DNS试剂 准确称 量 3,5-二硝基水杨酸 7.5g，加水500mL，然后逐步加入 NaOH14.0g，不断搅拌，直到溶液清澈透明。 再称取酒石酸钾钠 216.0g，重蒸苯酚5.6mL 或 5g和偏重亚硫酸钠 6.0g（为了加
8、速溶解，可加热，但溶液温度不能超过 48 ）。当加入的物质完全溶解， 冷却至室温后 ,用蒸馏水定容 到 1000mL。配好的溶液存放在棕色瓶中避光保存，室温下存放 5d 7d后使用。如果试剂出现沉淀或浑浊，需重新配制。 注 1： 称取氢氧化钠时速度要快 ,不然易吸潮。 注 2： 此试剂 1 2 月应更换一次。 注 3： 此试剂应具有足够的碱性 ,检验方法为 :用 0.1mol/L 盐酸滴定含酚酞的 3mLDNS 试剂 ,到终点时若盐酸用量小于6.2 mL,则需补加氢氧化钠至 pH 13.4 方可使用。 A.2.3 柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液 1mol/L柠檬酸-氢氧化钠缓冲液：称取一水柠檬酸 2
9、10g，加蒸馏水750mL ，再加入氢氧化钠 78g，充分溶解冷却后测 pH值 4.2，最后用蒸馏水定容至 1000mL，得到1mol/L 柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液，其 pH值4.45。将 1mol/L柠檬酸- 氢氧化钠缓冲液稀释 20倍，即可得到 0.05mol/L、 pH值 4.80的柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液。 A.2.4 1mol/L醋酸溶液 准确吸取冰醋酸 5.7mL，用蒸馏水定容至 100mL。 A.2.5 0.5mol/L氢氧化钠溶液 准确称取氢氧化钠 2.0g，用蒸馏水定容至 100mL。 A.2.6 1.2木聚 糖 溶液 DB41/T 780 2013 5 称取烘干后的山毛榉木
10、 聚糖 （ 木聚糖含量 90 ） 1.2g， 加入 0.5mol/L的 NaOH溶液 10mL，用磁力搅拌器搅 拌 30min， 加入 0.05mol/L柠檬酸-氢氧化钠 缓冲液 40mL， 用 1mol/L的醋酸溶液 缓慢 调 整 至 pH4.8。再用 0.05mol/L柠檬酸-氢氧化钠 缓冲液定容至 100mL，然后在 3500r/min条件下离心 10min，取上清液 备用 。 A.2.7 10mg/mL木糖母液 称取于 85 烘干的木糖 1.0000g，用 0.05mol/L柠檬酸 -氢氧化钠 缓冲液溶解，并定 容至 100mL。配好的木糖母液，置于 4 冰箱中冷 藏 。 A.3 仪器
11、 除普通试验室仪器外，还应有 : 分光光度计； 酸度计：pH 精度 0.01； 往复式水浴恒温振荡器：温度精度 1.0； 分析天平：感量 0.0001g； 磁力搅拌器； 秒表或定时钟； 移液器：1mL 5mL、 100 L 1000 L、 20 L 200 L、 5 50 L 各一支 。 A.4 分析步骤 A.4.1 绘制标准曲线 木糖标准曲线的测定按以下程序 : a) 将 10mg/mL 的标准木 糖溶液用 0.05mol/L、 pH 值 4.80 的柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液稀释成一系列浓度梯度的糖液 ,分别为 :0.10mg/mL、 0.20mg/mL、 0.30mg/mL、 0.40mg
12、/mL、 0.50mg/mL、0.60mg/mL、 0.70mg/mL。 b) 上述不同浓度的糖液各取 1.0 mL,置于已编号的 10mL 具塞刻度试管中 ,同时补加 0.05mol/L、pH 值 4.80 的柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液 0.5mL,空白对照为 0.05mol/L、 pH 值 4.80 的柠檬酸- 氢氧化钠缓冲液 1.5 mL。 c) 每管中均加入 2mL DNS 试剂并混匀 ,在沸水浴中保温 5min(注意 :水沸腾时开始计时 ),迅速冷却至室温 ,加水稀释至 10mL 并摇匀。 d) 利用分光光度计在 540nm 波长下测定 各管的吸光值 ,用空白管调零点； e) 以吸光值
13、为横坐标 ,木糖含 量为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,并拟合回归方程， 得到 线性回归方程 y =ax + b，线 性回归方程的 R2大于 0.999，用标准木糖溶液反标曲线，准确无误后方可使用，否则 应 重做。 注：标准曲线每半 月需校正一次；每重配一次 DNS，应重做一条标准曲线 。 A.4.2 待测酶液制备 液体酶按 照 GB/T 6678和 GB/T 6680的规定采样，吸取待测酶液，在5000r/min 条件下离心 5min，取上清液， 用 0.05mol/L、 pH值 4.80的柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液稀释至适当倍数（ 使试 样液与空白液的吸光度之差恰好落在 0.2 0.4范围内） ，
14、 检测酶活。 DB41/T 780 2013 6 固体酶按照 GB/T 6679的规定采样，样品混合均匀后，取适量样品配制成 粗酶液， 在 5000r/min条件下离心 5min，取上清液， 稀释方法同上（液体酶 稀释） ，检测酶活。 A.4.3 测定步骤 A.4.3.1 取四支10mL比色管（一支空白管，三支样品管），分别向四支比色管中加入 0.05mol/L的柠檬酸 -氢氧化钠 缓冲液0.45m L及 1.2%的木聚糖底物 1mL；分别加入 0.05mL适当稀释过的酶液 于三支样品管中（空白管不加） ， 整个反应体系的总体积为 1.5mL。盖紧塞子， 将四支比色管同时置于（ 50 1） 水
15、浴振荡器中， 80次 /min往复震荡，计时反应 30min，取出。立即准确地向各管中加入 2.0mL DNS试剂。再于空白管中加入 0.05mL稀释好的待测酶液，将四支管同时放入沸水浴中，加热 5min，取出，迅速冷却至室温，定容至 10mL，摇匀。 A.4.3.2 用空白管（对照液， 0.05mL加热灭活的酶液）调仪器零点，在分光光度计波长 540nm下，用 10mm比色皿，分别测量三支平行管中样液的吸光度，取平均值。以吸光度平均值查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。 A.5 计算公式 酶活力按式（ A.1）计算 。 05.03013.150 1000 fDWX . (A.1) 式中： X 样品 的酶活力， U/g(或 U/mL)； W 酶解反应产生的 葡萄糖 量 （ 由标准曲线 y=ax+b得到 ）， mg； Df 稀释倍数 ； 1000 转化因子， 1mmol=1000 mol； 150.13 木糖的摩尔质量， g/mol； 30 酶解反应 时间，min； 0.05 反应体系吸取的酶量， mL。 A.6 允许差 同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10 。 变异系数不超过 10。 _
