1、 DB41 河南省地方标准 DB 41/T 779 2013 纤维乙醇用纤维素酶制剂 2013- 01 - 28 发布 2013- 03 - 28 实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 779 2013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河南省质量技术监督局提出。 本标准由河南天冠纤维乙醇有限公司、南阳市质量技术监督检验测试中心起草。 本标准主要起草人：王林风、闫德冉、阎振丽、赵子高、吕世锋、吴金辉、马明。DB41/T 779 2013 1 纤维乙醇用纤维素酶制剂 1 范围 本标准规定了纤维乙醇用纤维素酶制剂的术语和定义、要求、试验方法、检验
2、规则和标志、包装、运输、贮存。 本标准适用于以木霉属（ Trichoderma）为代表的微生物及其变异株，经液态或固态发酵后制得的纤维素酶制剂。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 191 包装储运图示标志 GB/T 6678 化工产品采样总则 GB/T 6679 固体化工产品采样通则 GB/T 6680 液体化工产品采样通则 GB/T 6682 分析实验用水规格和实验方法 GB/T 16285 食品中葡萄糖的测定 酶 比色法和酶 电极法 QB
3、/T 1803 工业酶制剂通用试验方法 QB/T 1804 工业酶制剂通用检验规则和标志、包装、运输、贮存 定量包装商品计量监督管理办法 国家质量技术监督检验检疫总局 令 2005第 75号 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 纤维素酶 在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。 3.2 -葡萄糖苷酶 将纤维 二糖或 其他分子的纤维寡糖分解成葡萄糖的酶。 3.3 滤纸酶活力 （ FPA） 在（50 1）、 pH4.8条件下， 每分钟分解 滤纸 底物生成相当于 1mol葡萄糖 的 酶 量，定义为一个酶活力单位，以 U表示。 DB41/T 7
4、79 2013 2 3.4 -葡萄糖苷酶活力 在（50 1） 、 pH4.8条件下， 每分钟分解纤维二糖底物 产生 1.0mol葡萄糖 的酶 量，定义 为 一 个酶活力单位，以 U表示。 4 要求 4.1 外观 4.1.1 液体剂型 ： 棕色或浅黄色液体，无异味，允许有少量凝聚物。 4.1.2 固体剂型 ：棕黄色粉状或颗粒状， 无异味。 4.2 理化要求 应符合表 1的要求。 表 1 项目 液体剂型 固体剂型 滤纸酶活 力 200 U/mL 400 U/g -葡萄糖苷酶活力 40 U/mL 200 U/g 干燥失重 8.0% 细度（ 40目标准筛通过率） 80% pH值（ 25） 4.0 6.
5、0 4.3 净含量及允许短缺量 净含量及允许短缺量见表 2。 表 2 净含量 g或 mL 允许短缺量 g或 mL 5000 75 25000 250 50000 500 5 试验方法 5.1 外观 5.1.1 液体剂型：按 GB/T 6680 规定的采样方法，取 10mL 样品于 15mm150mm 试管中，目测鼻嗅。 5.1.2 固体剂型 ：按 GB/T 6679 规定的采样方法，取 10g 样品，目测鼻嗅。 DB41/T 779 2013 3 5.2 理化要求 5.2.1 滤纸酶活力（ FPA） 按附录 A规定的 方法 进行 。 5.2.2 -葡萄糖苷酶 活力 按附录 B规定的方法进行 。
6、 5.2.3 干燥失重 按QB/T 1803 规定的方法进行。 5.2.4 细度 按QB/T 1803 规定的方法进行。 5.2.5 pH 值 按QB/T 1803 规定的方法进行 。 5.3 净含量及允许短缺量 按定量包装商品计量监督管理办法规定的方法进行。 6 检验规则和标志、包装、运输、贮存 6.1 采样 采样按 GB/T 6678和 GB/T 6680常温下为流动态液体的规定进行。所采样品总量不得少于 2L，将样品充分混匀后，分装于两个干燥清洁带有磨口塞的玻璃瓶中。一瓶作为检验分析用，一瓶保留 1个月，以备查验。 6.2 检验规则和标志、包装、运输、贮存 应符合 QB/T 1804的要
7、求 。 6.3 包装储运图示标志 按GB/T 191 的规定执行。 6.4 保质期 6.5 在 25以下，固体剂型保质期 180d，保质期内酶活力应不低于标示酶活力的 85%。 6.6 在 25以下，液 体剂型保质期 90d，保质期内酶活力应不低于标示酶活力的 85%。 DB41/T 779 2013 4 A A 附 录 A （规范性附录） 滤纸酶活力（ FPA）测定方法 A.1 原理 纤维素酶在一定温度和 pH条件下，将纤维素底物（滤纸）水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下， 3,5-二硝基水杨酸与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖含量成正比。在 540nm下测其吸光度，可得到还原糖
8、的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活。以此代表纤维素酶的滤纸酶活力。 A.2 试剂和 溶液 A.2.1 试剂和水 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水均符合 GB/T 6682中规定的二级水。 A.2.2 DNS试剂 称取3,5 -二硝基水杨酸 7.5，溶于500mL水中，然后逐步加入氢氧化钠14g，不断搅拌，直到溶液清澈透明。再称取酒石酸钾钠 216.0g，重蒸苯酚5.6mL 或 5g和偏重亚硫酸钠 6.0g（为了加速溶解，可加热，但温度不能超过 48）。当加入的物质完全溶解后，冷却至室温后用蒸馏水定容至 1000mL，配好的溶液存在棕色瓶中，避光保存，室温下存放 5d 7d后使用，如果试剂出现浑
9、浊或沉淀，需重新配制。 注 1： 称氢氧化钠时速度要快 ,不然易吸潮。 注 2： 此试剂 1 2 月应更换一次。 注 3： 此试剂应具有足够的碱性 ,检验方法为 :用 0.1mol/L 盐酸滴定含酚酞的 3mLDNS 试剂 ,到终点时若盐酸用量小于6.2 mL,则需补加氢氧化钠至 pH 13.4 方可使用。 A.2.3 柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液 1mol/L柠檬酸- 氢氧化钠缓冲液：称取一水柠檬酸 210g，加蒸馏水750mL，再加入氢氧化钠 78g，充分溶解冷却后测 pH值 4.2，最后用蒸馏水定容至 1000mL，得到 1mol/L柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液，其 pH值约 4.45。将1mo
10、l/L柠檬酸- 氢氧化钠缓冲液稀释 20倍，即可得到 0.05mol/L、 pH值 4.80的柠檬酸-氢氧化钠缓冲液。 A.2.4 葡萄糖标准贮备溶液 10mg/mL标准葡萄糖溶液：精确称量于（ 105 2）条件下烘干至恒重的无水葡萄糖 (分析纯) 1.000g,充分溶解于 0.05mol/L、 pH值 4.80的柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液中, 并定容至100mL, 得到 10mg/mL的标准葡萄糖溶液。 A.2.5 滤纸 快速定性滤纸（ Whatman 1号滤纸），型号： 1001 110。 A.3 仪 器 DB41/T 779 2013 5 除普通试验室仪器外，还应有： 分光光度计； 酸度计
11、：pH 精度 0.01； 往复式水浴恒温振荡器：温度精度 1.0； 分析天平：感量 0.1mg； 磁力搅拌器； 秒表或定时钟。 A.4 分析步骤 A.4.1 绘制标准曲线 葡萄糖标准曲线的测定按以下步骤 : a) 将 10mg/mL 的标准 葡萄糖溶液用 0.05mol/L、 pH 值 4.80 的柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液稀释成一系列浓度梯度的糖液 ,分别为 :0.20 mg/mL、0.30 mg/mL、 0.40 mg/mL、 0.50 mg/mL、0.60mg/mL 。 b) 上述不同浓度的糖液各取 1.0mL,置于已编号的 10mL 比色管中, 同时补加 0.5mL 0.05mol/L、
12、 pH值 4.80 的柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液 ,空白对照为 1.5 mL 0.05mol/L、 pH 值 4.80 的柠檬酸- 氢氧化钠缓冲液。 c) 每管中均加入 2mL DNS 试剂并混匀 ,在沸水浴中保温 5min(注意 :水沸腾时开始计时 ),迅速冷却至室温 ,加水稀释至 10mL 并摇匀。 d) 利用分光光度计在 540nm 波长下测定各管的吸光值 ,用空白管调零点； e) 以吸光值为横坐标 ,葡萄糖含量为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,并拟合回归方程， 得到 线性回归方程y =ax + b，线性回归方 程的 R2大于 0.999，用标准葡萄糖液反标曲线，准确无误后方可使用，否则 应 重
13、做。 注：标准曲线每半 月需校正一次；每重配一次 DNS，应重做一条标准曲线 。 A.4.2 测定样品 A.4.2.1 待测酶液的制备 液体酶按照 GB/T 6678和 GB/T 6680的规定采样 ，吸取待测酶液，在 5000r/min条件下离心 5min，取上清液， 用 0.05mol/L、 pH值 4.80的柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液稀释至适当倍数（ 使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在 0.2 0.4范围内） ， 检测酶活。 固体酶 按照 GB/T 6679的规定采样，样品混合均匀后，取适量样品配制成 粗酶液， 在 5000r/min条件下离心 5min，取上清液， 稀释方法同上（液体酶
14、 稀释） ，检测酶活。 A.4.2.2 滤纸条的制备 将滤纸制成宽 1cm、长 6cm 、质量为（ 50 0.5） mg的滤纸条，折成 M型 。 A.4.3 分析步骤 A.4.3.1 取四支 10mL比色管（一支空白管，三支样品管）。将折好的滤纸条，放入比色管底部。分别加入稀释好的待测酶液 0.05mL于三支样品管中（空白管不加），向四支管中准确加入 0.05mol/L、 pH值 为 4.80的柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液 1.45mL。使滤纸条充分浸没，盖塞。整个反应体系的总体积为 1.5mL。 DB41/T 779 2013 6 A.4.3.2 将四支比色管同时置于（ 50 1） 水浴振荡器中
15、，往复震荡80次/ min，计时反应 30min，取出。立即准确地向各管中加入 2.0mL DNS试剂。再于空白管中加入 0.05mL稀释好的待测酶液，将四支 管同时放入沸水浴中，加热 5min，取出，迅速冷却至室温，定容至 10mL，摇匀。 A.4.3.3 用空白管（对照液， 0.05mL加热灭活的待测酶液）调仪器零点，在分光光度计波长 540nm下，用 10mm比色皿，分别测量三支平行管中样液的吸光度，取平均值。以吸光度平均值查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。 A.5 结果计算 按式（ A.1）计算。 X = 05.030180 1000 fDW (A.1) 式中： X 样品 的
16、滤纸酶活力， U/g(或 U/mL)； W 酶解反应产生的 葡萄糖 量 (由标准曲线 y=ax+b得到 )， mg； Df 稀释倍数 ； 1000 转化因子， 1mmol=1000 mol； 180 葡萄糖的摩尔质量， g/mol； 30 酶解反应时间， min； 0.05 反应体系吸取的酶量， mL。 A.6 精密度 同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10 。 变异系数不超过 10。 DB41/T 779 2013 7 B B 附 录 B （规范性附录） -葡萄 糖苷酶活力测定方法 B.1 原理 -葡萄糖苷酶在一定温度和pH条件下，将 -葡萄 糖苷酶底物（纤维二糖）水解，释
17、放出葡萄糖，计算出葡萄糖苷酶的酶活力。 本标准葡萄糖量检测方法采用 GB/T 16285的方法进行。 B.2 试剂和 溶液 B.2.1 试剂 和水 除非另有说明，分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水。 B.2.2 柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液 1mol/L柠檬酸-氢氧化钠缓冲液：称取一水柠檬酸 210g，加蒸馏水750mL ，再加入氢氧化钠 78g，充分溶解冷却后测 pH值 4.2，最后用蒸馏水定容至 1000mL，得到1mol/L 柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液，其 pH值约 4.45。将 1mol/L柠檬酸 -氢氧化钠缓冲液稀释 20倍，即可得到 0.05mol/L、 pH值 4.80的柠檬酸-氢
18、氧化钠缓冲液。 B.2.3 15mmol/L纤维二糖溶液 准确称取纤维二糖 1.0269g，用 0.05mol/L、 pH值 4.80的柠檬酸- 氢氧化钠缓冲液 定容至 200mL，备用。 B.3 仪器 除普通实验室仪器外，还应有以下仪器： 酸度计：pH 精度 0.01； 生物传感器：葡萄糖检测范围 0 150mg/100Ml； 往复式水浴恒温振荡器：温度精度 1.0； 分析天平： 感量 0.1mg/0.01mg； 磁力搅拌器； 秒表或定时钟； 沸水浴（可用 1000W 电炉和高角烧杯、搪瓷量杯或其他容器组成） 。 B.4 分析步骤 B.4.1 待测酶液制备 取样品液离心（ 5000 r/mi
19、n），取上清液，准确稀释定容（使试样与空白的测量值落在 0 100之间）放置 5min，待测。 DB41/T 779 2013 8 B.4.2 操作程序 B.4.2.1 取四支 10mL比色 管（一支空白管，三支样品管） ， 分别向四支管中准确加入相应 pH的缓冲溶液1mL， 分别准确加入稀释好的待测酶液（A.4.2.1） 0.05mL于三支样品管（空白管不加）中。分别准确加入 15mmol/L纤维二糖溶液 1mL于 四 支样品管中，盖塞。 B.4.2.2 将四支 比色 管同 时置于（ 501） 水 浴中， 往复震荡 80次 /min，准确 计时，预热 5min，反应30min，取出。 再于空
20、白管中加入 0.05mL待测酶液， 迅速将四支 试 管放入沸水浴煮沸 5min，取出，迅速冷却至室温，摇匀。 反应产生的葡萄糖量采用 GB/T 16285-2008的方法进行。 B.5 结果计算 -葡萄糖苷酶活力按式（ B.1）计算。 05.03018010001 nAX(B.1) 式中： X1 样品的 -葡萄糖苷酶活力 ， U/g(或 U/mL)； A 仪器测定的 葡萄糖量 ， mg/100mL； 30 酶解 反应时间 ， min； 180 葡萄 糖的摩尔质量， g/mol； 0.05 反应酶液体积 ,mL； N 酶样稀释倍数 。 B.6 允许差 同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%。变异系数不超过 10%。 _
