1、湖南省地方标准DB43辣椒品种纯度鉴定 SSR分子标记法Protocol for purity identification of pepper variety by SSR molecular markersDB43/T 9872015 ICS 65.020.20B 05湖南省质量技术监督局 发 布2015-03-23 实施2015-01-23 发布DB43/T 9872015 I 目 次 前言 1 范围 12 原理 13 仪器设备、试剂和耗材 13.1 主要仪器设备 13.2 主要试剂 13.3 主要耗材 14 试剂配制 14.1 DNA提取试剂 14.2 PCR 扩增试剂 24.3 变性
2、聚丙烯凝胶电泳试剂 24.4 银染、显影试剂 24.5 显影液 35 引物 36 操作步骤 36.1 供试品种样品制备 36.2 DNA 提取 36.3 PCR 反应体系和程序 36.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 36.5 染色和显色 47 统计与计算 4附录 A（资料性附录） 部分 SSR 引物信息 6DB43/T 9872015 II 前 言 本标准按照GB/G 1.12009给出的规则起草。 本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。 本标准由湖南省农业标准化技术委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：湖南省蔬菜研究所。 本标准主要起草人：郑井元、刘峰、邹学
3、校、张竹青、马艳青、戴雄泽、李雪峰。 DB43/T 9872015 1 辣椒品种纯度鉴定 SSR分子标记法 1 范围 本标准规定了辣椒品种纯度SSR分子标记鉴定技术。 本标准适用于采用SSR分子标记法进行辣椒品种纯度鉴定。 2 原理 简单重复序列（Simple sequence repeats: SSR）随机分布于辣椒全基因组的不同位置上，不同品种或品系每个位点上重复单位的数量和序列可能不同，从而形成片段长度多态性。根据基因组中每个简单重复序列两侧序列的保守性，设计一对特异引物，利用PCR(Polymerase Chain Raction)技术进行扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，
4、经硝酸银染色，从而判别PCR产物的电泳谱带，通过选用供试品种间具有广泛多态性的SSR引物，依据PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳谱带差异，鉴定辣椒品种纯度。 3 仪器设备、试剂和耗材 3.1 主要仪器设备 研钵、液氮罐、电子天平、恒温水浴锅、高速台式离心机（14 000 r/min）、紫外分光光度计、高压灭菌锅、PCR扩增仪、电泳仪、垂直电泳槽、凝胶成像系统、酸度计、微量移液器、摇床、通风柜、数码相机、胶片观察灯、冰箱（4和-20）。 3.2 主要试剂 乙二胺四乙酸二钠、盐酸、氢氧化钠、液氮、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸钠、三氯甲烷、乙醇、异丙醇、异戊醇、dNTP(dATP、dCTP、d
5、GTP、dTTP)引物、Taq DNA聚合酶、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、四甲基乙二胺、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛、醋酸钠，所以试剂符合分析纯以上标准。 3.3 主要耗材 离心管、移液枪枪头、96孔PCR扩增板、玻璃板、一次性手套、一次性口罩。 4 试剂配制 4.1 DNA提取试剂 4.1.1 0.5 mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）（ pH8.0）溶液 称EDTA186.1 g，加入已有800 mL双蒸水的烧杯中，用氢氧化钠调节pH值至8.0，补双蒸水DB43/T 9872015 2至1000 mL，用玻璃棒摇匀，分装至100 mL的玻璃瓶中，灭菌后室温保存备用。 4.1.
6、2 1 mol/L Tris-HCl（三羟基氨基甲烷盐酸，pH8.0）溶液 称121.1 g Tris加入含有800 mL双蒸水的烧杯中，用盐酸调节pH值至8.0，补双蒸水定容至1000 mL，摇匀，4冰箱中保存备用。 4.1.3 DNA提取液 取1 mol/L Tris-HCl溶液50 mL、0.5 mol/L EDTA溶液20 mL，称SDS 7.5 g和NaCl 14.6 g加入到500 mL烧杯中，用双蒸水定容至 500 mL，充分混匀，使得溶液中的最终浓度Tris-Cl 为100 mmol/L，EDTA 20 mmol/L，NaCl 500 mmol/L，SDS 1.5%（v/v）。
7、 4.1.4 氯仿:异戊醇:乙醇（80:4:16） 取160 mL三氯甲烷，8 mL异戊醇和32 mL无水乙醇加在一起混匀，4冰箱保存备用。 4.2 PCR扩增试剂 PCR 扩增所用的 dNTP、Taq DNA聚合酶-20保存。合成的引物用灭菌双蒸水配置成 100 mol/L的储存液，从中取 10 L加 90 L 双蒸水配置成10 mol/L的工作液，-20保存备用。 4.3 变性聚丙烯凝胶电泳试剂 4.3.1 10TBE 缓冲液 称取 108 g Tris，55 g 硼酸，40 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)，加入烧杯中，用双蒸水定容到1000 mL，摇匀，室温保存。 4.
8、3.2 40% PAGE（丙烯酰胺）溶液 称380 g丙烯酰胺和20 g甲叉双丙烯酰胺加双蒸水定容至1000 mL，4保存备用。 4.3.3 10%（W/V）过硫酸铵溶液（APS） 称0.1 g过硫酸铵，加入1 mL双蒸水，混匀，现配现用。 4.3.4 1TBE缓冲液 取10TBE 缓冲液200 mL，加双蒸水1800 mL，摇匀。 4.3.5 6加样缓冲液 称取溴酚蓝0.25 g，二甲苯青0.25 g，加98 mL甲酰胺溶液和2 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）溶液，混匀，室温保存备用。 4.3.6 8% PAGE胶 10TBE 4 mL、40% PAGE 8 mL、双蒸水
9、28 mL、10% 过硫酸铵 400 L、TEMED 20 L，总体积40 mL，试验中可根据垂直板的大小按比例配置凝胶。 4.4 银染、显影试剂 4.4.1 固定液 DB43/T 9872015 3 冰醋酸100 mL，加双蒸水900 mL，配置成10%的的冰醋酸溶液，摇匀，室温保存。 4.4.2 染色液 称1.5 g硝酸银，加双蒸水1000 mL溶解，再加1.5 mL甲醛，混匀，室温保存。 4.5 显影液 称15 g 氢氧化钠，加入1000 mL双蒸水溶解，再加7.5 mL甲醛，混匀，室温保存。 5 引物 从公共序列数据库中下载EST序列，利用Trinity软件进行组装，然后用SSR程序检
10、索包含有SSR位点的序列，随后对这些序列用Primier3软件设计引物，再对不同来源的EST序列分别进行E-PCR引物多态性筛选，最后通过对不同品种的辣椒组织 DNA 进行实验验证，得到多态性 SSR 引物。部分 SSR引物的序列信息见附录A。 6 操作步骤 6.1 供试品种样品制备 取供试杂交辣椒种子120粒，父母本各（510）粒，辣椒种子先在10%的次氯酸钠溶液中浸种（810 ）min，并不时摇动，用灭菌水冲洗干净后置于28的恒温培养箱中催芽，露白后播种于育苗钵内。育苗基质以草木灰（或草炭）、蛭石、菜地土以2:1:1的比例混合，在28左右的温室里育苗，幼苗长到（24）叶期用于DNA提取。
11、6.2 DNA提取 在2 mL离心管中加入0.8 mL DNA提取缓冲液，60水浴预热，取幼苗或叶子100 mg，剪碎， 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60水浴保温60 min， 不时摇动，然后加入 0.8 mL 氯仿:异戊醇溶液，颠倒混匀 (需带手套， 防止损伤皮肤)，室温下静置（510）min后10,000 rpm离心5 min；将上清仔细移至另一2 mL离心管， 加入1倍体积异丙醇，混匀， 室温静置3 min，5,000 rpm离心5 min，去除上清，用70%的乙醇洗涤沉淀2次，待乙醇全部风干后，加入500 L 60预热的双蒸水，再加入 5 L RNas
12、eA(10 g/L)，37温浴 10 min，最后加入 1/10体积的3 mol/L NaAc及2倍体积的冰乙醇，混匀，-20放置20 min，5,000 rpm离心5 min，去上清，用70%的乙醇洗涤沉淀2次，风干乙醇后加入200 L 60预热的双蒸水，用紫外分光光度计检测DNA浓度并将DNA溶液用双蒸水稀释到20 ng/L，-20冰箱中保存备用。 6.3 PCR反应体系和程序 PCR扩增反应体系10 L，包括：10Buffer 1 L，0.5 L dNTP（1mm），1 L（2 pmol，F+R）引物，0.1 L Taq（5U/L）酶和 1 L DNA（20 ng/L）模板，ddH2O
13、5.4 L。扩增程序：94 5 min；94 30 s，58 30s，72 30 s，35个循环后72 延伸5 min，扩增完后4保存。 6.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 6.4.1 玻璃板处理 DB43/T 9872015 4用自来水和海绵球加少许清洗液将玻璃板清洗干净，再用蒸馏水冲洗（12）遍，待透光条件下玻璃板上无细小杂质时，室温下晾干。 6.4.2 玻璃板组装 玻璃板彻底晾干后，盖上凹槽玻璃板，将玻璃板放在塑料隔条中，仔细对齐玻璃板，使玻璃板与塑料隔条紧密吻合。 6.4.3 封胶 称0.3 g琼脂粉，加30 mL1TBE缓冲液，微波炉上加热完全溶解后，用5 mL移液器取适量加到玻璃板下面
14、的空隙里，琼胶液渗入玻璃板凹槽中3 mm左右，室温放置30 min。 6.4.4 玻璃板与电泳槽组装 将封胶好的玻璃板放在电泳槽中，使玻璃板周边的塑料条与电泳槽的卡位紧密吻合，拧紧螺丝，将电泳槽的正极和负极与电泳仪连接。 6.4.5 灌胶 将现配的8% PAGE（丙烯酰胺）凝胶，轻轻摇匀，缓缓灌入玻璃胶室，胶灌满整个胶室后，插入样品梳，室温下聚合90 min。胶完全聚合后，加入0.5TBE电泳缓冲液，拔出样品梳。 6.4.6 点样与电泳 每个PCR产物中加5 L6加样缓冲液，混匀，每个加样孔加入（34）L样品。180 V 恒温电泳90 min左右，待指示剂（6加样缓冲液中的二甲苯青）接近胶板底
15、部时，停止电泳。 6.5 染色和显色 6.5.1 固定 电泳结束后，分开两块玻璃板，将附着凝胶的玻璃板放入固定液中，轻轻揭下胶板，放在30 r/min的水平摇床中，摇15 min，倒出固定液，加入500 mL蒸馏水，在30 r/min的水平摇床中，摇10 min。 6.5.2 染色 倒掉蒸馏水，加入200 mL染色液，在30 r/min的水平摇床中，摇10 min，倒出染色液，用蒸馏水漂洗2次。 6.5.3 显色 加400 mL显影液，轻轻摇动，待条带清晰后，倒掉显影液，迅速加入固定液定影5 min，用蒸馏水漂洗2次。最后将胶板置于胶片观察灯上，拍照记录。 7 统计与计算 SSR位点表现双亲带
16、型，说明是真杂交种；仅出现单个亲本带型或其他带型，则为假杂种。杂交种子纯度（Pure：P）的数值以%表示，按公式（1）计算： 100= N nNp （1） DB43/T 9872015 5 公式中： P 品种纯度 N 检测的种子数量 n 非双亲带型的种子数量DB43/T 9872015 6附录A （资料性附录） 部分SSR引物信息 引物编号 引物序列 扩增片段长度范围（bp） EST-SSR-1F TGAACATGCAAGGAGCTGAC 22210 EST-SSR-1R CACACGTTCGCGTTTTGTTA EST-SSR-2F AAAATCAAGCGGCAAAAGG 26310 EST
17、-SSR-2R ATTGCGGTCCTCTACATTGG EST-SSR-3F ATTCATCATCGTCGTCGTCA 27510 EST-SSR-3R AACATTATCCTTTCTCGGGGA EST-SSR-4F TCATTGACCAATGGAAGCAA 25410 EST-SSR-4R TGTTTCTCGTGCAGAATTGG EST-SSR-5F TTTGAGTGAACAGGATCCAAA 25710 EST-SSR-5R GGTCGTCTTACCAGCTGCAT EST-SSR-6F CGGCCAGTACCAGTTGTCTT 20210 EST-SSR-6R CTGCTCTCAC
18、CTTTGTTCCC EST-SSR-7F ATCCCTTCTTCTCCTTCCCC 15610 EST-SSR-7R TCTCTTTCTGTCTCTGTCTCTCTCTG EST-SSR-F GAGAGAGAGAGAGAGAGCACCC 2510 EST-SSR-R GAAATGGCAATTTGGGAGAA EST-SSR-9F GGGCCGATGTAAGCAGACTA 20610 EST-SSR-9R TCCCACACAAGAGTGACCAA EST-SSR-10F TGTGAGCGAGAGAGAGAGAGAG 27910 EST-SSR-10R TCACATATTTGGCATTCGGA
19、EST-SSR-11F CCGCTCAGTGATAAAGGAGG 27410 EST-SSR-11R TTACGGAACTCATCATCCCC EST-SSR-12F CCGATACGCTTCACTGGATT 27710 EST-SSR-12R GGCAGAGCCCAAACAGAGTA EST-SSR-13F AGAGAGGGAAAACATGTCGG 21910 EST-SSR-13R TTTCCATTGGGAATGTCGAT EST-SSR-14F CAGCCGAGAGAGAGAGAGAGA 12910 EST-SSR-14R ATTACCTTGCAGCACCAACC EST-SSR-15F
20、 TTCCCGGAGAGAGAGAGAGA 20010 EST-SSR-15R GACACGAGTTTGCCTGTTGA EST-SSR-16F TCACGTGATTTGTTTAGGACCA 26310 EST-SSR-16R GTAGGGTACAGGGTCCCCC EST-SSR-17F TGAGAACTTCTTTCTGGCGG 27210 EST-SSR-17R TGAGGCTGTGGACTTGTCAG EST-SSR-1F TTTCCCTTTTACGGCTGATG 21210 EST-SSR-1R TAGATGAAGAAACGGGGTGG DB43/T 9872015 7 引物编号 引物
21、序列 扩增片段长度范围（bp） EST-SSR-19F GGCATCTTTGAGCATAGGGA 14910 EST-SSR-19R AGAGCACCACCCAGGATATG EST-SSR-20F GGTGGCCAGAAAAGTAATCC 16610 EST-SSR-20R AGCCCTAACATGGCTGCTAA EST-SSR-21F TGGGGATCTAAACATGAAGG 23510 EST-SSR-22R CATGTGGGATGATGAATGGA EST-SSR-23F TGGATTCGTCATGGTTCAAG 21510 EST-SSR-23R CGCGAATCTCATCTGAT
22、CCT EST-SSR-24F CGAGGCTTCCCTTTTCTCTC 17510 EST-SSR-24R TCGCCAAGGACGATAACTTT EST-SSR-25F GCTGGAGTGGTTGCAAAAAT 1310 EST-SSR-25R GTGGGTTTCCAATGAATGCT EST-SSR-26F AAGCTTCCTTGAGCTCCTCC 1110 EST-SSR-26R CAAAACGAAGACGGGAATGT EST-SSR-27F ATTCTCTTCCACCGCCTTTT 14310 EST-SSR-27R TCCGTTAAAGCACCATTTCC EST-SSR-2F
23、 TAAGAGCAAGGAGGCTCTGC 19610 EST-SSR-2R GACATGATCCAACCCAATCC EST-SSR-29F CCTTCCTAGCCACACACCTC 14710 EST-SSR-29R GAAGGAATAACCGGCAGCTA EST-SSR-30F TCACGTGATTTGTTTAGGACCA 26310 EST-SSR-30R GTAGGGTACAGGGTCCCCC EST-SSR-31F TGAGAACTTCTTTCTGGCGG 27210 EST-SSR-31R TGAGGCTGTGGACTTGTCAG EST-SSR-32F TTTCCCTTTTACGGCTGATG 21210 EST-SSR-32R TAGATGAAGAAACGGGGTGG EST-SSR-33F GGCATCTTTGAGCATAGGGA 14910 EST-SSR-33R AGAGCACCACCCAGGATATG EST-SSR-34F AAGCTTCCTTGAGCTCCTCC 1110 EST-SSR-34R CAAAACGAAGACGGGAATGT EST-SSR-35F ACGGCAGGTTGTTGAGAAGT 17210 EST-SSR-35R ATGCGACAATCGACAAACAA
