1、 ICS 65.020.01 B 04 天 津 市 地 方 标 准 DB12DB12/T 5042014 水稻转基因成分筛查方法 Screening method for genetically modified rice 2014-04-22发布 2014-07-20实施天津市质量技术监督局发布 DB12/T 5042014 1 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由天津市质量技术监督局提出。 本标准起草单位：天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。 本标准主要起草人：黄凤军、朱珠、易萌、杨炳存、刘文、赵新、李阳、闫荣卿。 本标准20
2、14年04月首次发布。 DB12/T 5042014 1 水稻转基因成分筛查方法 1 范围 本标准规定了水稻中转基因成分定性PCR筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。 本标准适用于水稻及其制品中SPS基因、CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因、NPTII基因和HPT基因的定性PCR筛查检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 农业部14
3、85号公告42010 转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化 农业部2031号公告192013 转基因植物及其产品检测 抽样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 SPS基因 SPS gene 编码蔗糖磷酸合酶（sucrose phosphate synthase）的基因。 3.2 CaMV 35S启动子 35S promoter from cauliflower mosaic virus （CaMV） 来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。 3.3 NOS终止子 terminator of nopaline synthase （NOS） gene 来自胭脂碱合成酶基因NOS
4、的终止子。 3.4 Bt基因 Bt（Bacillus thuringiensis）gene 来源与苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因。 3.5 NPTII基因 NPTII gene 来源于大肠杆菌（Escherichia coli），编码新霉素磷酸转移酶（neomycin phosphotransferase）的基因。 3.6 HPT基因 HPT gene 来自大肠杆菌或链球菌（Streptomyceshy groscopicus），编码潮
5、霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase）的基因。 DB12/T 5042014 2 4 检测方法 4.1试剂和材料 4.1.1 实验用水为重蒸馏水或符合GB/T 6682规定的一级水。 4.1.2 琼脂糖。 4.1.3 10 g/L溴化乙锭溶液：称取1.0 g溴化乙锭（EB），溶于100 mL水中，避光保存。 注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。 4.1.4 10 mol/L氢氧化钠溶液：在160 mL水中加入80.0 g氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容到200 mL。 4.1.5 500 mmol/L乙二铵四乙酸二钠
6、溶液（pH 8.0）：称取18.6 g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70 mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液（4.1.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（4.1.4）调pH至8.0，加水定容至100 mL。在103.4 kPa（121 ）条件下灭菌20 min。 4.1.6 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）：称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800 mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1 000 mL。在103.4 kPa（121 ）条件下灭菌20 min。 4.1.7 TE缓冲液（pH 8.0）：分别量取10 mL三羟
7、甲基氨基甲烷-盐酸溶液（4.1.6）和2 mL乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），加水定容至1 000 mL。在103.4 kPa（121 ）条件下灭菌20 min。 4.1.8 50TAE缓冲液：称取242.2 g三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用300 mL水加热搅拌溶解后，加100 mL乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1 000 mL。使用时用水稀释成1TAE。 4.1.9 加样缓冲液：称取250.0 mg溴酚蓝，加10 mL水，在室温下溶解12 h；称取250.0 mg二甲基苯腈蓝，用10 mL水溶解；称取50.0 g蔗糖，用30 mL水溶解。
8、混合以上三种溶液，加水定容至100 mL，在4 下保存。 4.1.10 DNA分子量标准：可以清楚的区分50 bp1 000 bp的DNA片段。 4.1.11 dNTPs混合溶液：将浓度为10 mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。 4.1.12 Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液及25 mmol/L氯化镁溶液。 4.1.13 引物：水稻内标准基因和转基因水稻外源基因检测时所用的引物序列见表1。 表1 水稻内标准基因和转基因水稻外源基因引物序列 检测基因 引物序列 扩增片段长度 基因性质 SPS SPS -F： 5-ATCTGTTTACTCG
9、TCAAGTGTCATCTC-3 SPS -R： 5-GCCATGGATTACATATGGCAAGA-3 287 bp 内标准基因 CaMV 35S 35S -F：5-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3 35S -R：5-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 195 bp 外源基因 NOS NOS -F：5-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3 NOS -R：5-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 180 bp 外源基因 Bt Bt -F：5- GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC -3 Bt -R：5- CGATCAGCCTAGTAAG
10、GTCGT-3 301 bp 外源基因 NPTII Npt-F：5- ACTGGGCACAACAGACAATCG -3 Npt-R：5- GCATCAGCCATGATGGATACTTT -3 289 bp 外源基因 HPT hpt -F：5- GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT -3 hpt -R：5- AGATGTTGGCGACCTCGTATT -3 472 bp 外源基因 DB12/T 5042014 3 4.1.14 引物溶液：用TE缓冲液（4.1.7）或水分别将上述引物稀释到10 mol/L。 4.1.15 石蜡油。 4.1.16 PCR产物回收试剂盒。 4.1.17 DNA
11、提取试剂盒。 4.2 仪器 4.2.1 分析天平：感量0.1 g 和0.1 mg。 4.2.2 PCR扩增仪：升降温速度1.5 /s，孔间温度差异1.0 。 4.2.3 电泳槽、电泳仪等电泳装置。 4.2.4 紫外透射仪。 4.2.5 凝胶成像系统或照相系统。 4.2.6 重蒸馏水发生器或纯水仪。 4.2.7 其他相关仪器设备。 4.3 分析步骤 4.3.1 抽样 按NY/T 672 和农业部2031号公告192013规定的执行。 4.3.2 试样准备 按NY/T 672 和农业部2031号公告192013规定的执行。 4.3.3 试样预处理 按农业部1485号公告42010规定的执行。 4.
12、3.4 DNA模板制备 按农业部1485号公告42010规定的执行。 4.3.5 PCR反应 4.3.5.1 试样PCR反应 4.3.5.1.1 每个试样PCR反应设置3次重复。 4.3.5.1.2 在PCR反应管中按表2依次加入反应试剂，混匀，再加25 L石蜡油（有热盖设备的PCR仪可不加）。 表2 PCR检测反应体系 试剂 终浓度 体积 水 10PCR缓冲液 1 2.5 L 25 mmol/L氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs混合溶液（各2.5 mmol/L） 各0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L正向引物 0.20.5 mol/L 0.52.5L DB
13、12/T 5042014 4 10 mol/L反向引物 0.20.5mol/L 0.52.5L Taq酶 0.025 U/L 25 mg/L DNA模板 2 mg/L 2.0 L 总体积 25.0 L 根据Taq酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到25.0 L。如果PCR 缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积水。 注：SPS基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别是SPS-F1和SPS-R，引物终浓度分别为0.2mol/L； CaMV35S启动子PCR检测反应体系中，上下游引物分别是35S-F和35S-R，引物终浓度分别为0.4mol/L；NOS终止子PCR检
14、测反应体系中，上下游引物分别是NOS-F和NOS-R，引物终浓度分别为0.4mol/L；Bt基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别是Bt-F和Bt-R，引物终浓度分别为0.5mol/L；NPTII基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别是 Npt-F和 Npt-R，引物终浓度分别为0.2mol/L；HPT 基因 PCR检测反应体系中，上下游引物分别是hpt-F和hpt-R，引物终浓度分别为0.2mol/L。 4.3.5.1.3 将PCR管放在离心机上，500 g3 000 g离心10 s，然后取出PCR管，放入PCR扩增仪中。 4.3.5.1.4 进行PCR反应。反应程序按表3进行。 表3
15、PCR反应程序 被扩增的基因 变性 扩增 循环次数 最终延伸 SPS 94 ，5 min 94，30s 58，30s 72，30s 35 72 ，2 min CaMV35S 94 ，5 min 94 ，30 s 60 ，30 s 72 ，30 s 35 72 ，7 min NOS 94 ，5 min 94 ，30 s 60 ，30 s 72 ，30 s 35 72 ，7 min Bt 95 ，5 min 94 ，1 min 56 ，30 s 72 ，30 s 35 72 ，7 min NPTII 94 ，5 min 94 ，30 s 60 ，30 s 72 ，30 s 35 72 ，7 min
16、 HPT 94 ，5 min 94 ，30 s 60 ，30 s 72 ，30 s 35 72 ，7 min 4.3.5.1.5 反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。 4.3.5.2 对照PCR反应 在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。 以非转基因水稻基因组 DNA 作为阴性对照；以含有 SPS、CaMV35S、NOS、Bt、NPTII、HPT 基因的转基因水稻质量分数为0.1%1.0%的基因组DNA作为阳性对照；以水作为空白对照。 DB12/T 5042014 5 各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与7.5.1相同。 4.3.
17、6 PCR产物电泳检测 按20 g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100 mL琼脂糖溶液中加入5 L EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12 L PCR产物与3 L加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2 V/cm5 V/cm条件下电泳检测。 4.3.7 凝胶成像分析 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像系统或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。
18、如需通过序列分析确认 PCR 扩增片段是否为目的DNA片段，按照4.3.8和4.3.9的规定执行。 4.3.8 PCR产物回收 按PCR产物回收试剂盒说明书，回收PCR扩增的DNA片段。 4.3.9 PCR产物测序验证 将回收的PCR产物克隆测序，与水稻SPS、CaMV35S、NOS、Bt、NPTII、HPT基因序列（参见附录A）进行比对，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。 5 结果分析与表述 5.1 对照检测结果分析 阳性对照的 PCR 反应中，内标准基因和外源基因均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出内标准基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表
19、明 PCR 反应体系正常。否则表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。 5.2 样品检测结果分析和表述 5.2.1 在试样的 PCR 反应中，内标准基因得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致；而 SPS基因、CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因、NPTII基因和HPT基因均未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出转基因成分。结果表述为“试样中未检测出 CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因、NPTII基因和HPT基因，检测结果为阴性”。 5.2.2 在试样的PCR反应中，内标准基因得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致； CaMV35S启
20、动子、NOS终止子、Bt基因、NPTII基因和HPT基因中任何一个得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明试样中检测出转基因成分。结果表述为“试样中检测出XXX，检测结果为阳性”。 DB12/T 5042014 6 附录A （资料性附录） A.1 SPS 基因PCR扩增产物核苷酸序列 1 ATCTGTTTAC TCGTCAAGTG TCATCTCCTG AAGTGGACTG GAGCTATGGG GAGCCTACTG 61 AAATGTTAAC TCCGGTTCCA CTGACGGAGA GGGAAGCGGT GAGAGTGCTG GTGCGTACAT 121 TGTGCGCATT C
21、CGTGCGGTC CAAGGGACAA GTACCTCCGT AAAGAGCCCT GTGGCCTTAC 181 CTCCAAGAGT TTGTCGACGG AGCTCTCGCG CATATCTGAA CATGTCCAAG GCTCTGGGGG 241 AACAGGTTAG CAATGGGAAG CTGGTCTTGC CATATGTAAT CCATGGC 注：划线部分为引物序列 A.2 CaMV 35S启动子PCR扩增产物核苷酸序列 1 GCTCCTACAA ATGCCATCAT TGCGATAAAG GAAAGGCTAT CATTCAAGAT GCCTCTGCCG 61 ACAGTGGTC
22、C CAAAGATGGA CCCCCACCCA CGAGGAGCAT CGTGGAAAAA GAAGACGTTC 121 CAACCACGTC TTCAAAGCAA GTGGATTGAT GTGATACTTC CACTGACGTA AGGGATGACG 181 CACAATCCCA CTATC 注：划线部分为引物序列 A.3 NOS终止子PCR扩增产物核苷酸序列 1 GAA TCCTGTTGCC GGTCTTGCGA 61 TGATTATCAT ATAATTTCTG TTGAATTACG TTAAGCATGT AATAATTAAC ATGTAATGCA 121 TGACGTTATT TATGA
23、GATGG GTTTTTATGA TTAGAGTCCC GCAATTATAC ATTTAATACG 181 CGATAGAAAA CAAAATATAG CGCGCAAACT AGGATAA 注：划线部分为引物序列 A.4 Bt基因PCR扩增产物核苷酸序列 1 GAAGGTTTGA GCAATCTCTA CCAAATCTAT GCAGAGAGCT TCAGAGAGTG GGAAGCCGAT 61 CCTACTAACC CAGCTCTCCG CGAGGAAATG CGTATTCAAT TCAACGACAT GAACAGCGCC 121 TTGACCACAG CTATCCCATT GTTCGCAGT
24、C CAGAACTACC AAGTTCCTCT CTTGTCCGTG 181 TACGTTCAAG CAGCTAATCT TCACCTCAGC GTGCTTCGAG ACGTTAGCGT GTTTGGGCAA 241 AGGTGGGGAT TCGATGCTGC AACCATCAAT AGCCGTTACA ACGACCTTAC TAGGCTGATC 301 G 注：划线部分为引物序列 A.5 NPTII基因PCR扩增产物核苷酸序列 1 ACTGGGCACA ACAGACAATC GGCTGCTCTG ATGCCGCCGT GTTCCGGCTG TCAGCGCAGG 61 GGCGCCCGGT T
25、CTTTTTGTC AAGACCGACC TGTCCGGTGC CCTGAATGAA CTGCAGGACG 121 AGGCAGCGCG GCTATCGTGG CTGGCCACGA CGGGCGTTCC TTGCGCAGCT GTGCTCGACG 181 TTGTCACTGA AGCGGGAAGG GACTGGCTGC TATTGGGCGA AGTGCCGGGG CAGGATCTCC 241 TGTCATCTCA CCTTGCTCCT GCCGAGAAAG TATCCATCAT GGCTGATGC 注：划线部分为引物序列 DB12/T 5042014 7 A.6 HPT基因PCR扩增产物核苷酸
26、序列 1 GAAGTGCTTG ACATTGGGGA GTTTAGCGAG AGCCTGACCT ATTGCATCTC CCGCCGTGCA 61 CAGGGTGTCA CGTTGCAAGA CCTGCCTGAA ACCGAACTGC CCGCTGTTCT ACAACCGGTC 121 GCGGAGGCTA TGGATGCGAT CGCTGCGGCC GATCTTAGCC AGACGAGCGG GTTCGGCCCA 181 TTCGGACCGC AAGGAATCGG TCAATACACT ACATGGCGTG ATTTCATATG CGCGATTGCT 241 GATCCCCATG TGTATCACTG GCAAACTGTG ATGGACGACA CCGTCAGTGC GTCCGTCGCG 301 CAGGCTCTCG ATGAGCTGAT GCTTTGGGCC GAGGACTGCC CCGAAGTCCG GCACCTCGTG 361 CACGCGGATT TCGGCTCCAA CAATGTCCTG ACGGACAATG GCCGCATAAC AGCGGTCATT 421 GACTGGAGCG AGGCGATGTT CGGGGATTCC CAATACGAGG TCGCCAACAT CT 注：划线部分为引物序列
