1、 ICS 67.050 B 23 天 津 市 地 方 标 准 DB12 DB12/T 651 2016 转基因耐除草剂大豆 GTS40-3-2 及其衍生品种定量检测 实时荧光 PCR 方法 Detection of genetically modified plants and derived products Quanlitative PCR method for herbicide-resistant soybean GTS 40-3-2 and its derivates 2016-09-27 发布 2016-11-01 实施 天津市 市 场和质量监督管理委员会发布 DB12/T 651
2、 2016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由 天津市 农村工作 委员会 提出 。 本标准起草单位： 天津市农业质量标准与检测技术研究所 、中国农业科学院生物技术研究所 、 天津市 质量技术监督宝坻检测中心 。 本标准主要起草人： 兰青阔、 宛煜嵩 、 杨炳存、 赵新、 李亮、 陈锐、朱珠、刘娜 、王成 、徐石勇 。 本标准 2016 年 9 月首次发布。 DB12/T 651 2016 1 转基因耐除草剂大豆 GTS40-3-2 及其衍生品种定量检测 实时荧光 PCR 方法 1 范围 本标准规定了转基因 耐除草剂大豆 GTS 40-3-2 转化体
3、特异性定量 PCR 检测 方法 的 术语和定义、检测方法、结果 计算 。 本标准适用于转基因 耐除草剂大豆 GTS 40-3-2 及其衍生品种，以及制品中 GTS 40-3-2 转化体的定量 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 农业部 1485 号公告 4 2010 转基因植物及 其产品 成分 检测 DNA 提取和纯化 农业部 2031
4、号公告 19 2013 转基因植物及其产品检测 抽样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 Lectin 基因 Lectin gene 编码大豆凝集素的基因。 3.2 GTS 40-3-2 转化体 特异性序列 event-specific sequence of GTS 40-3-2 GTS 40-3-2 外源插入片段 5端与大豆基因组的连接区序列，包括 35S 启动子部分序列和大豆基因组的部分序列。 4 原理 根据大豆外源基因和内标基因特异 性序列设计引物和 TaqMan 荧光探针，对标准样品和试样同时进行实时荧光 PCR 扩增。根据标准样品模板拷贝数与 Ct 值间的线性关系
5、，分别绘制外源基因和 内标基因的标准曲线。计算试样中外源基因和内标基因的拷贝数及其比值。 5 检测 方法 5.1 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1.1 TaqMan 荧光 PCR 反应试剂盒。 DB12/T 651 2016 2 5.1.2 引物和探针。 5.1.2.1 Lectin 基因。 lec-1215F： 5-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3 lec-1332R： 5-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3 lec-1269P： 5-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-3 预期扩增片
6、段大小为 118 bp（参见附录 A） 。 5.1.2.2 GTS40-3-2 转化体特异性序列。 GTS40-3-2F： 5- CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG - 3 GTS40-3-2R： 5- GACTTGTCGCCGGGAATG - 3 GTS40-3-2P： 5 -CGCAACCGCCCGCAAATCC- 3 预期扩增 片段大小为 121 bp（参见附录 A） 。 用 水 分别将上述引物 和探针 稀释到 10 mol/L， 探针需避光保存。 5.2 仪器 分析天平： 感量 0.1 g 和 0.1 mg； 荧光定量 PCR 扩增仪 ； 核酸定量仪 ； 重蒸馏水发生器或
7、纯水仪 ；其他相关仪器设备。 5.3 分析 步骤 5.3.1 抽样 按 NY/T 672 和 农业部 2031 号公告 19 2013 规定 执行。 5.3.2 试样准备 按 NY/T 672 和 农业部 2031 号公告 19 2013 规定 执行。 5.3.3 试样预处理 按农业部 1485 号公告 4 2010 规定 执行。 5.3.4 DNA 模板制备 按农业部 1485 号公告 4 2010 规定 执行 。 5.3.5 标准曲线样品制备 采用相同的标准样品绘制 GTS40-3-2 转化体和 Lectin 内标基因的标准曲线。提取 GTS40-3-2 标准物质基因组 DNA，用 0.1
8、TE 或水稀释至 1105-5105 copies/L（相当于 20-100 ng/L），作为初始模板。然后再用 0.1TE 梯度稀释初始模板，制备不同浓度的 GTS40-3-2 标准溶液。标准溶液至少涵盖 5 个 GTS40-3-2 浓度梯度，最低浓度拷贝数小于 200， 最高浓度拷贝数大于 40000。 5.3.6 PCR 反应 5.3.6.1 标准样品和试样实时荧光 PCR 反应 同时进行标准样品和试样的 PCR 反应， 每个 PCR 反应设置 3 次 平行 。 GTS40-3-2 转化体实时荧光 PCR 反应 按表 1 在 PCR 反应管中依次加入反应试剂 ， 混匀 ； Lectin
9、内标基因实时荧光 PCR 反应 按DB12/T 651 2016 3 表 2 在 PCR 反应管中依次加入反应试剂 ， 混匀。 将 PCR 管放在离心机上， 500 g3 000 g 离心 10 s，然后取出 PCR 管，放入 PCR 仪中。运行实时荧光 PCR 反应。反应程序为： 95 变性 2 min；进行 45次 循环扩增反应（ 95 变性 15 s， 60 退火延伸 1 min）；在第二阶段的退火延伸（ 60 ）时段收集荧光信号。 表 1 GTS40-3-2 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 TaqMan 反应缓冲液 1 10 mol/L GTS40-3-2F 0.8 mol/L
10、2.0 L 10 mol/L GTS40-3-2R 0.8 mol/L 2.0 L 10 mol/L GTS40-3-2P 0.4 mol/L 1 .0 L DNA 模板 2.0 L 无菌水 总体 积 25.0 L 根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。“ ”表示体积不确定。根据 TaqMan 反应液的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。 表 2 Lectin 内标 基因 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 TaqMan 反应缓冲液 1 10 mol/L lec-1215F 0.2 mol/L 0.5 L 10 mol/L lec-1332R 0.2 mo
11、l/L 0.5 L 10 mol/L lec-1269P 0.2 mol/L 0.5 L DNA 模板 2 .0 L 无菌水 总体积 25.0 L 根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。“ ”表示体积不确定。根据 TaqMan 反应液的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。 5.3.6.2 设置对照 应设置阴性对照和空白对照。 以非转基因大豆材料提取的 DNA 作为 GTS40-3-2 转化体特异性检测的阴性对照的模板；以鲑鱼精子 DNA 作为 Lectin 内标基因检测的阴性对照的模板；用纯水作为空白对照 PCR 反应体系的模板。 各对照 PCR 反应体系中
12、，除模板外其余组分及 PCR 反应条件与 5.3.6.1.4相同。 5.3.7 数据分析 5.3.7.1 设定阈值 实时荧光 PCR 反应结束后，以 PCR 刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值，并根据仪器噪声情况进行调整。设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平行间重复性良好。 5.3.7.2 记录 Ct 值 DB12/T 651 2016 4 设定阈值后，荧光定量 PCR 仪的数据分析软件自动计算每个反应的 Ct 值，并记录。 5.3.7.3 绘制标准曲线 根据标准溶液的扩增 Ct 值和初始模板拷贝数的对 数间的线性关系，分别绘制 GTS40-3-2 转化体和
13、Lectin 内标基因的标准曲线。 标准曲线公式： 式中： y 测试样品的 Ct 值； a 标准曲线的斜率； x 模板拷贝数以 10 为底数的对数； b 标准曲线的截距。 5.3.7.4 数据可接受的标准 GTS40-3-2 阴性对照和空白对照的 GTS40-3-2 转化体 Ct 值 38； Lectin 阴性对照和空白对照的Lectin 内标基因 Ct 值 38； 标准曲线的 R20.98，标准曲线斜率 -3.6 且 -3.1； 满足 上述 条件，可以进行结果计算 。否则重新进行实时荧光 PCR 扩增。 5.3.7.5 含量计算 5.3.7.5.1 计算试样模板拷贝数 将试样的 GTS40-
14、3-2 转化体和 Lectin 内标基因的 Ct 值分别带入 GTS40-3-2 转化体和 Lectin 内标基因的标准曲线方程，计算 GTS40-3-2 转化体和 大豆 内标准基因 Lectin 的拷贝数。 计算试样模板拷贝数公式： aby10(2) 式中： n 模板拷贝数 y 测试样品的 Ct 值； a 标准曲线的斜率； b 标准曲线的截距。 5.3.7.5.2 计算试样中转基因含量 将 GTS40-3-2 转化体拷贝数和 Lectin 内标基因拷贝数带入公式（ 3），计算出试样中 GTS40-3-2 百分含量。 计算试样中 GTS40-3-2 转化体百分含量的公式： 100 % (3)
15、式中： c 试样中 GTS40-3-2 的百分含量 (%)； nGTS40-3-2 GTS40-3-2 转化体拷贝数； nLectin 大豆 内标准基因 Lectin 拷贝数。 DB12/T 651 2016 5 6 结果分析与表述 6.1 Lectin 内标基因和 GTS40-3-2 转化体均 出现典型 扩增 曲线 ，且 Lectin 内标基因和 GTS40-3-2 转化体的 Ct 值 36， 表明样品中检出 耐除草剂 大豆 GTS40-3-2 转化体。 表 述为“样品中检测出 GTS40-3-2 转化体， GTS40-3-2 转化体含量为 c”。 6.2 Lectin 内标基因出现典型扩增
16、曲线，且 Ct 值 36， GTS40-3-2 转化体 Ct 值 38 或未出现典型扩增曲线 ， 表明样品中未检出 耐除草剂 大豆 GTS40-3-2 转 化体。 表 述为“样品中未检测出 GTS40-3-2 转化体”。 6.3 Lectin 内标基因和 GTS40-3-2 转化体出现典型扩增曲线， Lectin 内标基因 Ct 值 36， GTS40-3-2 转化体 Ct 值在 36 38 之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合 6.1-6.2 的情况，依照 6.1-6.2 进行判断；如重复实验 GTS40-3-2 转化体出现典型扩增曲线，但 Ct 值仍在 36 38 之间，则判定样品检出
17、GTS40-3-2 转化体，表述为“样品中检测出 GTS40-3-2 转化体” 。 6.4 Lectin 内标基因和 GTS40-3-2 转化体未出现典型扩增曲线 ，或 Ct 值 38， 表明样品中未检出 大豆 。表 述为“样品中未检测出 大豆 成分”。 6.5 Lectin 内标基因和 GTS40-3-2 转化体出现典型扩增曲线 ，但 Ct 值均在 36 38 之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合 6.1-6.4 的情况，依照 6.1-6.4 进行判断；如重复实验 Lectin 内标基因和GTS40-3-2 转化体出现典型扩增曲线，但 Ct 值仍在 36 38 之间，则判定样品检出 GT
18、S40-3-2 转化体，表述为“样品中检测出 GTS40-3-2 转化体”。 DB12/T 651 2016 6 附录 A （ 资料性附录 ） A.1 Lectin基因 实时荧光 PCR扩增产物核苷酸 序列 （ Accession No.K00821） 1 GCCCTCTACT CCACCCCCAT CCACATTTGG GACAAAGAAA CCGGTAGCGT TGCCAGCTTC 61 GCCGCTTCCT TCAACTTCAC CTTCTATGCC CCTGACACAA AAAGGCTTGC AGATGGGC 注：划线部分为 lec-1215F 和 lec-1332R 引物序列，方框内为探针 lec-1269P 序 列。 A.2 耐除草剂大豆 GTS40-3-2转 化体特异性 序列 1 CCTTTAGGAT TTCAGCATCA GTGGCTACAG CCTGCATGCT TCACGGTGCA AGCAGCCGGC 61 CCGCAACCGC CCGCAAATCC TCTGGCCTTT CCGGAACCGT CCGCATTCCC GGCGACAAGT C 注 1： 划线部分为 GTS40-3-2F 和 GTS40-3-2R 引物序列 ，方框内为探针 GTS40-3-2P 序列 。 注 2： 1 67 为外源插入片段部分序列， 68 120 为大豆基因组部分序列。 _
