1、ICS 65.020 B 16 备案号： 56065-2017 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 1431 2017 桃树根癌病综合防治技术规程 Technical regulations for control of peach crown gall (Agrobacterium tumefaciens)2017 - 06 - 29发布 2017 - 10 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 1431 2017 I 目 次 前言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 病情分级 1 5 防治措施 2 5.1育苗期预防措施 2 5.2苗
2、木选择与定植 2 5.3 田间管理 2 5.4 药剂防治 2 6 育苗期预防效果调查 2 附 录 A （资料性附录） 症状特征 . 3 附 录 B （资料性附录） 发病规律 . 4 附 录 C （资料性附录） 检测方法 . 5 参考文献 7 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009 相关规则起草。 本标准由北京市园林绿化局提出并归口。 本标准由北京市园林绿化局组织实施。 本标准起草单位：北京市林业保 护站、中国农 业大学 。 本标准参与起草单位：北京 流村王 园果园。 本标准 主要 起草 人： 王合、米莹、郭岩彬、王建辉、周在豹、杜金萍、龚硕、张崇岭、卢绪利、吴 有刚、王永明、王睿
3、琦、赵连祥 。 DB11/T 1431 2017 1 桃树根癌病综合防治技术规程 1 范围 本标准规定 了桃树根癌病病情分级 、防治措施和育苗期防治效果调查。 本标准适 用于北京 地区桃树根癌病 的防治，樱桃、樱花等植 物根癌 病的防治可 参照执行 。 2 规范性引用文件 下列文件 对于 本文件 的应 用是必不可少的 。 凡是注日 期 的引用文件 ，仅所注日 期 的版 本适 用于本文 件。凡是不注日 期的 引用文件，其最新版 本（ 包括所有的修改 单） 适用 于本文件。 GB/T 8321.9 农 药合 理使 用准则（ 九） NY/T 2725 氯化 苦土壤消毒技术规 程 3 术语和定义 下列
4、术语和定义 适用 于本文件。 3.1 桃树根癌病 peach crown gall 又称桃树 冠瘿 病、桃树根 瘤病，是 一种细菌 性病 害，在根 颈和 根部产生肿瘤 ， 导致 树势衰弱 ， 甚至 死亡。 3.2 桃树根癌病病原菌 pathogenic bacterium of peach crown gall 引起桃树根癌 病的 病原菌 ，为根癌土壤 杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）。 3.3 抗根癌菌剂 root carcinoma bacteria resistance agent 对根癌 病菌具 有良好拮抗作 用 的微生 物制 剂。 4 病情分级 按肿瘤 发
5、生部 位将 病情分 为 5级 ，分级标准 如下 ： 0级：植 株无肿瘤； 1级： 肿瘤 发生 在须 根上； 2级： 肿瘤 发生 在侧 根上； 3级： 肿瘤 发生 在侧 根与 主根的连 接处； 4 级： 肿瘤 发生 在主根、根 颈或枝干上 。 DB11/T 1431 2017 2 桃树根癌 病症状特征参 见附录A ，发病规律参 见附录B ， 检测方法参 见附录 C。 5 防治措施 5.1育苗期预防措施 5.1.1 苗圃地选择 选择非 发病 地块作为 育苗 地， 避免 在前 茬为豆类 、 蔬菜以及 林地、 林业苗 圃等地块 育苗 ； 必要时可 对 育苗 地进 行土壤 熏蒸处 理, 按 GB/T 8
6、321.9和 NY/T 2725相关规定 执行 。 5.1.2砧木种子处理 选择抗 病的适 宜砧 木种子 ，播种 前， 用抗 根癌 菌剂 拌种处 理。 5.1.3 苗木嫁接 采用高 位芽接 法嫁接 ，避免接口与 土壤 接触；嫁接 前，使 用 75%酒精 对嫁接工具进 行消毒 处理。 5.1.4 苗木出圃 对 病情 为 1级、 2级 的 苗木剪除肿瘤 ， 剪除 的肿瘤及时销毁； 对病情 为 3级、 4级的 苗木 及时销毁。 5.2苗木选择与定植 5.2.1对无 症状苗木 及剪除肿瘤 的 1级、 2级苗木 进行蘸 根处 理并 及时 定植。 5.2.2定植前 ， 将抗 根癌菌 剂 放入陶瓷 、 塑
7、料等 非金 属容器 中， 加水 ， 按 1:1调 匀成 糊状 ， 将剪 根后的 桃 苗 浸入菌 液中， 浸入 深度超过 根颈上部 5cm，即 可拿出 栽植 ，随浸随栽 。 5.3 田间管理 5.3.1对于 碱性 土壤的 果园 ，适 当增 施酸 性肥 料、有 机肥 和果 树专 用肥 料。 5.3.2 减少 果园 土壤 清耕 等栽培 管理措施 以及 蛴螬 、蝼蛄 等地下 害虫 对根 系的 伤 害。 5.3.3 将大 水漫灌 、串灌 改为一 树一 畦的 单株 灌溉 或滴灌 。 5.4 药剂防治 对 已 发病 株及时 切下 肿瘤 ，用抗 根癌 菌剂 等药剂 涂抹伤口 ，切 下的 病瘤 随即 销毁。 6
8、 育苗期预防效果调查 苗木出 圃时 ， 调查 使用 抗 根癌菌 剂和 其它 处理 的苗木发病 等级 ， 计算 防治效果。病情 指数 与防治效 果分别 按式 （1 ）、 （2） 计算： 病情指数 = 4 调查总株数 级数值 相对 病株数 各级 100 (1) 防治效果 = 对 照 的 病情指数 的病情指数 对照的病情 指数 处 理 100% (2) DB11/T 1431 2017 3 附 录 A （资料性附录） 症状特征 A.1 地下部分症状 桃树根癌 病主要 发生 在根 颈部和 根部 ，包括 侧根 和须 根，树 干上 偶见 。根 部被 害 后通常形 成球形、 扁球形 或不 规则 的肿瘤 。
9、初 生瘤 乳白色 或略带红色 ， 光滑 ， 柔软 ， 后逐渐变褐色乃 至深褐色 ， 木 质 化 而 坚硬， 表面粗糙 或凹凸 不平 ， 龟裂 ，表面 细胞枯 死， 内 部木 质化 ，并 在瘤 的周 围 或表面 产生一 些细根。 最 后外皮 脱落， 露出 许多突 起状 小木 瘤 ， 瘤 的内 部 组织紊乱 并混 有薄壁 组织 及维管 束 ，在 较 大的根 瘤上 还会出 现许多小 瘤。 肿瘤 的数目 少的 12 个， 多的达 10余个 ， 直径差异很 大， 小 如豆 粒，大 如 胡 桃 和 拳头， 甚至 直径达 数十厘 米。 A.2 地 上部分症状 苗木和 新植 幼龄 桃树 受害 后， 发育 受阻
10、 ， 生长缓慢， 植 株矮小， 严重 时叶片黄 化 ， 早 衰 。 成 年果 树 受 害 后， 生长 不良 ，果实 小，甚至 全株死亡 。 DB11/T 1431 2017 4 A A 附 录 B （资料性附录） 发病规 律 B.1 病原菌 的越冬 病 原菌 在癌 瘤组织 的皮 层内 或 在癌 瘤破 裂脱 皮时进入 土壤中 越冬 ，细菌 在土壤中能存活多年 。 B.2病原菌 的侵入途径 病 菌 通过 嫁接 、昆 虫或 人为 因素造 成的 伤口 侵入 植株 。 B.3病原菌 的传播 雨 水 和灌溉 水是 自然传 播的主要 方式 ，苗木 带菌 是远距离传 播的 重要 途径 。 B.4 发病 条件
11、B.4.1 温度湿度 病菌侵染 与发病 需要 一定 的湿度 和温 度， 太低太 高均不利于 病害 发生 。 当 旬气温达到20 23.5， 地温18 20 以及 土壤 和水质 偏碱 时， 均有利于 该病菌 的侵染 为害 。 B.4.2 土壤 理化 性质 碱性土壤有利于 发病 ,土壤pH值在6.28 时均能 保 持病 菌 的致 病 力。 偏碱 性 的土壤和 湿度大的 沙壤 土 内 发生 重， 酸性和 粘重 的土壤中 很少 发病。 B.4.3 嫁接方 式 嫁接口 的部 位、 接口 大小 及愈合的 快慢均能影响 发病 程 度。 在苗 圃中， 嫁接 口与土壤 接触时 间 长 ， 染病机 会多 ，发病
12、率高 。 DB11/T 1431 2017 5 附 录 C （资料性附录） 检测方 法 C.1 致 病性 检测 C.1.1 致病菌分 离 取新鲜 的冠瘿瘤 ， 用 2%的 次 氯酸钠 表面 消毒 2min， 再 用 70%乙醇 表面 消毒 90s， 无菌生 理 盐水 清洗 3 5遍 ， 用 无菌剪 刀将冠瘿瘤剪 切 成0.5cm 的小 块， 加入2 5倍体积 的无菌生 理盐 水， 匀 浆后 ， 取 上清 ， 涂 板到土壤 杆菌 选择性 培养基 MW培 养基 上， 28 下培 养48h 72h 。 MW培养基 ：每升 培养基 中含 有 甘露 醇， 10.0 g；K 2HPO4，0.3 g ；生
13、物素 ，100 g； NaNO3，5.0 g ； NaCl， 0.2 g；MgSO 4 7H2O，0.1 g ； 0.1%结晶紫 ，2.0ml；0.1% Fe-EDTA， 2.0 ml；琼脂 ， 15g 20g。 pH，7.0 7.2； 121高 压灭 菌 30 min。 C.1.2 致病性 检测 取 分 离的 单菌 落， 接种 到LB 培养基 上培 养48h。 将待 测菌 液 配制成 浓度 为10 8CFU/ml的菌 悬液 (OD600 为0.6) 。用 灭 菌接种 针在 生长7d 10d 的向 日葵茎段上 刺 数下 造成 伤口 ， 吸 取 5 l10 l 待 测菌 液滴 到 无菌棉 球上
14、后放 置于 伤口 上， 以 封口 膜包 裹伤 口， 温 室内培 养15 d 后 观察结 瘤情 况 ， 形 成肿瘤 的为 发病。 C.2冠瘿碱的检测 方法 C.2.1检测 用试 剂 电泳检测 缓冲 液：按照 甲酸 :乙酸 :水为 5:15:80的比例配比 。 荧光染 液： 为菲醌 -乙醇溶液 ， 由0.02% 菲醌 -无水 乙醇 和 10%氢氧 化钠 /60%乙醇溶 液 按照 1： 1混合。 检测用标准 样品 ：胭脂 碱、 章鱼 碱标准 样品 ，精 氨酸 标准 样品 。 C.2.2 检测 方法 取植物 肿瘤 组织 1g 2g放入 离 心管 ，用 解剖针挤压 出汁液 ，离 心， 用毛 细管 取上清
15、 ，点 到滤纸上， 同 时 点胭脂 碱、 章鱼 碱和 精 氨酸标准 样品 。 在 甲酸 :乙酸 :水 =5:15:80溶液 中电泳1.5h， 电泳电压 为400V， 烘干滤纸 ， 用菲醌- 乙醇 染 液染色 ，在紫 外灯 下观测 荧光斑点 ， 与标准 样品比 较，含 有胭脂 碱或 者章鱼 碱 的 为发病。 C.3 核酸检测 C.3.1 选取待检测的 病菌 采用根癌土壤 杆菌 选择性 培养基 分离土壤 细菌 ， 选取 单 菌落 利 用PCR的 方法 快 速检测 致病性 根癌土 壤 杆菌 。 C.3.2 聚合 酶链式反应 （PCR）检测致 病性特 异性引 物 PCR 的 引 物 为 iaaHF2
16、（ 5 ACATGCATGAGTTATCGTTTGGAAT3 ） /iaaHR1 （ 5 GCATCAAGGTCATCGTAAAAGTAGGT3） ； iaaH-F10（ 5GGAAACATGCATGAGTTATCGTT3） /iaaH-R10（ 5 CCACATCAGCATCAAGGTCATC3）。 DB11/T 1431 2017 6 C.3.3 聚合 酶链式反应 （PCR）检测致 病性 反应体系 PCR的 反应 体系 为: 10 Buffer 2.5 ml dNTP (10mM) 1.0 ml 菌 液 (10ng/ml) 1.0 ml iaaHF2 (10mM)或iaaH-F10 0.2
17、5 ml iaaHR1 (10mM)或iaaH-R10 0.25 ml TaqDNA酶 (5U/ml) 0.2 ml ddH2O 19.8 ml total 25.0 ml C.3.4 聚合 酶链式反应 （PCR）检测致 病性 反应 程序 PCR反 应程 序如 下： 94 5 min 94 40 s 54 40 s 72 90 s 72 10 min 4 保 存 C.3.5 核酸检测的结 果 配制1% 浓度的 琼脂糖凝胶 ，凝胶电泳检测 ， iaaHF2/iaaHR1引物 能够扩 增，电泳 检测 为 420 bp 的 DNA条 带为致 病性 阳性 ； iaaH-F10/iaaH-R10引物 能
18、够扩 增， 电泳 检测 为 424 bp 的 DNA条带 可以进一 步确 定致病性 为阳 性； 两条 特异 性引 物菌无 法扩 增出 条带 的 为致 病性 阴性。 35 cycles DB11/T 1431 2017 7 参 考 文 献 1 GB 8370 1987 苹果苗木产 地检 疫规 程. 2 NY/T 51142002 无公 害 食品 桃 生产 技术规 程. 3 马德钦 ，王 慧敏 . 果 树根癌 病及 其生 物防治 J.中国 果树,1995,(2):42-44. 4 李健强 ，王 慧敏 ，张 桂火 等 . 一些 杀菌 剂和 抗菌 素对根癌 菌和 根癌 抑制菌 的作用 J.中国农业 大
19、学学 报,1996,(3):74-78. 5 王 慧敏 .植 物根癌 病的发 生 特点 与防治 对策 J.世界农 业,2000,(7):28-30. 6 刘焕芳 ，段 成国， 陈学 森 等. 核 果 类 果 树根癌 病 菌寄 主范围 及抗 性 研究初 报J. 北方果 树 ,2002,(5):4-7. 7 陶 万强 ，邢彦峰 ，王合等. 桃树根癌 病防治 技术 J.中国 果树 ,2004,(2):46-47. 8 罗 维德 ，杨 金兰 ，杨 永启. 桃树根癌 病防治 技术 探讨 J.中国 植保 导刊 ,2004,(3):13-17. 9 田 国忠 ， 李 永， 朱 水芳 等 . 我 国木本植物
20、致病性 土壤杆菌 的分子检测和 比较鉴定J. 林业 科 学 ,2006,(2):63-72. 10 罗正均，淮稳霞 ，赵 文 霞 等 . 我 国 木本植物根癌病检疫与防治问题思 考J. 林业科技开 发 树 ,2011,(4):6-11. 11 付丽 ，范 昆， 曲健禄等 . 樱桃根癌 病的 研究 进展 J.落叶 果树 ,2015,(2):19-21. 12 Bini F, Kuczmog A, Putnoky P, et al. Novel pathogen-specific primers for the detection of Agrobacterium vitis and Agrobacterium tumefaciensJ. VITIS-Journal of Grapevine Research, 2015, 47(3): 181. _
