1、 玉米品种纯度及真实性 SSR分子检测方法 SSR-based Method to Assay Purity and Genuineness in Zea mays L. ICS 65.020.20 B 21 备案号：21532-2007 北 京 市 地 方 标 准 DB DB11/T 5072007 2007-11-22发布 2008-02-01实施 北京市质量技术监督局发布DB11/T 5072007 I 前 言 本标准的附录 A 为规范性附录，附录 B 为资料性附录。 本标准由北京市农业局提出。 本标准由北京市农业标准化技术委员会种植业分会归口。 本标准起草单位：北京市种子管理站、北京市
2、农林科学院玉米研究中心、全国农业技术推广服务中 心。 本标准主要起草人：贾希海、郭景伦、辛景树、律宝春、田雷、吴明生、赵久然、王凤格、云晓敏、 郭慧杰。 DB11/T 5072007 1 玉米品种纯度及真实性 SSR 分子检测方法 1 范围 本标准依据 SSR 分子标记原理，规定了进行玉米单交种和亲本自交系的品种纯度及真实性检测方 法的仪器设备及试剂、引物筛选、试验步骤、纯度检测和真实性鉴定。 本标准适用于玉米单交种及亲本自交系的纯度及真实性检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 品种纯度 varietal purity 品种在 DNA 分子标记带型方面典型一致的程度，用
3、供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的 百分率表示。 2.2 品种真实性 varietal genuineness 供检品种与标准品种的符合程度。 2.3 SSR分子标记 simple sequence repeat marker 由寡核苷酸为单位的简单串联重复序列。 2.4 引物 primer 结合在模板 DNA 上的互补短链，提供 3-OH 末端作为 DNA 合成的起点，延伸合成模板 DNA的 互补链。 3 原理 在玉米基因组中普遍存在着由寡核苷酸为基本单位的简单串联重复序列， 品种间因其重复次数不同 而存在多态性，据此可以利用适宜引物进行 PCR 扩增，从而检测出特定 SSR 位点的多
4、态性，以鉴别品种 的纯度及真实性。 4 仪器设备及试剂 4.1 仪器设备 PCR 扩增仪；DNA 序列分析电泳槽；高压电泳仪（3000V, 400mA, 400W） ；电子天平（感量 0.01g, 0.001g） ；冰箱；微量加样器（0.5L10L, 20L200L, 100L1000L） ；磁力搅拌器；胶片观 察灯；水平摇床；高压灭菌锅；酸度计等。 烧杯；镊子；刻刀；量筒；容量瓶（500mL，1000mL） ；离心管（0.5mL，1.5mL） ；吸头(10L，200L， 1000L)；注射器（100mL） ；96 孔深孔板；96孔 PCR 板；封板膜；一次性手套；离心管架；染色盒（55cm
5、38cm8cm） ；水平仪；夹子等。 4.2 试剂 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2） ；三羟甲基氨基甲烷（Tris） ；盐酸（HCl，36%） ；氢氧化钠(NaOH)； 10倍PCR 缓冲液（不含Mg 2+ ） ，保存条件为-20；氯化镁（MgCl2） ；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs） ，保 存条件为-20；TaqDNA聚合酶（5U/L） ，保存条件为-20；SSR 引物，保存条件为-20；矿物油；DB11/T 5072007 2 去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青 FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；尿素；亲和硅烷（Binding Silane） ；剥离硅烷（Repel Silane）
6、；无水乙醇；四甲基乙二胺；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛 溶液等。 DNA 提试剂、PCR 反应试剂、电泳试剂和银染试剂的成分及配制按附录 A执行。 5 引物筛选 适宜引物筛选应遵守扩增后的杂交种 SSR 电泳谱带含有双亲谱带，而且带型清晰、重复性好的原 则。 可以利用已经公开发表的引物，也可以自行筛选引物。自行筛选时，取测试杂交种种子 10 粒及父 母本种子各 5 粒，利用一系列引物进行分析，从中确定适宜的引物。 常见适用于玉米品种的纯度及真实性分析的 SSR 引物名称及序列参见附录 B。 6 方法步骤 6.1 DNA 提取 剥取种胚，分别放入 96 孔深孔板中。每孔加入 150L DNA
7、提取液，盖封板膜，煮沸 5min 后，在 每孔中加入 150L TE 缓冲液，形成样品 DNA 溶液。 样品 DNA 溶液可以直接进行 PCR 扩增或在冰箱中冷冻长期保存。 6.2 扩增 取 96 孔 PCR 反应板一块，每孔中依次加入 13.5 L 超纯水、2 L 10 倍 PCR 缓冲液、2.5 L MgCl2 （25 mmol/L） 、 1.2L dNTP(2.5 mmol/L)、 0.25L SSR引物 （20 mol/L） 、 0.25L TaqDNA 聚合酶(5U/ L)， 混匀。 每孔再加入 2 L 样品 DNA 溶液和 1 滴矿物油，盖封板膜后放入 PCR 仪，扩增程序为：94
8、预变性 5min；94变性40s，60退火35s，72延伸45s，循环35 次；72延伸5min；4保存。 6.3 检测 6.3.1 胶板制作 将玻璃板洗净，用无水乙醇擦洗两遍，干燥。在长玻璃板上涂 0.5%亲和硅烷（Binding Silane） 0.5mL，带凹槽的玻璃板上涂 2.0%剥离硅烷（Repel Silane）0.5mL。操作过程中防止两块玻璃板互相 污染。待玻璃板彻底干燥后，将长玻璃板水平放置，在玻璃板上面垂直方向两边放置边条，并与玻璃边 缘对齐，然后，将带凹槽的玻璃板放在长玻璃板的上面，四周对齐，并在有边条的两边用夹子固定，水 平仪调平。 吸取 4.5%PA胶 80mL，加入
9、四甲基乙二胺 80L 和 25%过硫酸铵 80 L，迅速摇匀。在凹槽一端，沿 灌胶口一边轻轻敲打，一边将胶灌进，灌胶过程中防止出现气泡。待胶流动到另一端，在凹槽一端，将 梳子齿向外，轻轻的插入梳子，使其聚合 1h 以上。 6.3.2 预电泳 在正极槽（下槽）和负极槽（上槽）中分别加入 1 倍 TBE 缓冲液 600ml，拔出梳子，90W 恒功率预 电泳15 min20 min。 6.3.3 点样 20l PCR 扩增样品加入 4 l 6 倍加样缓冲液，混匀后，在 PCR 仪上变性：95变性5 min，4冷 却 10 min。用吸球吹吸加样槽,清除气泡和残胶，插入样品梳子，每一个加样孔点入 5
10、l 样品。 6.3.4 电泳 80W 恒功率电泳 30 min。 6.3.5 染色 电泳结束后，分开两块玻璃板。将带凝胶的玻璃板浸入固定液中轻轻晃动 3min，再放入去离子水 中漂洗 10s，然后将胶板放入染色液中染色 5min。 DB11/T 5072007 3 将染色后的胶板放入去离子水中漂洗 10s，然后在显影液中轻轻晃动直至带纹清晰。 将显影后的胶板放入固定液中定影 5min，再用去离子水漂洗 1min。 7 纯度检测 7.1 取样 从送检样品中随机取不少于 100 粒种子。 7.2 SSR 分析 按照本标准第 6 章规定的方法步骤进行。 7.3 数据计算和表示 100 % = 供检种
11、子粒数 非本品种种子粒数 供检种子粒数 （自交系） 品种纯度 100 % = 供检种子粒数 其他类型种子粒数 母本种子粒数 供检种子粒数 （单交种） 品种纯度 8 真实性鉴定 8.1 取样 分别从送检样品和标准样品中各随机抽取10粒种子。 8.2 SSR 分析 利用 40 对 SSR 核心引物，按照本标准第 6 章规定的方法步骤进行。对样本间存在差异的引物和样 本内个体之间存在差异的引物，从送检样品和标准样品中分别重新取样进行复检。 8.3 结果判定 送检样品与标准样品之间未检测出差异，判定送检样品与标准样品属于同一品种。 送检样品与标准样品有一对以上（包括一对）引物检测出差异，判定送检样品与
12、标准样品不属于 同一品种。 送检样品或标准样品存在两种或两种以上带型，以出现次数最多的一种带型作为该样品典型带型。 DB11/T 5072007 4 附 录 A （规范性附录） 主要试剂配制 A.1 DNA提取试剂配制 A.1.1 10 mol/L 氢氧化钠（NaOH）溶液：取NaOH 80g，先用160 mL蒸馏水溶解后，再加水定容至200 mL。 A.1.2 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） ：取EDTA-Na2 186.1g，加入100 mL蒸馏水，再加入适量10 mol/L N aOH溶液，加热至完全溶解后，冷却至室温，用10 mol/L 氢氧化钠溶液调pH值至8.0，加水
13、定容至1000 mL，高压灭菌。 A.1.3 1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0） ： 取三羟甲基氨基甲烷(Tris) 60.55g溶于适量蒸馏水中， 用盐酸(H Cl)调pH至8.0，加水定容至500mL，高压灭菌。 A.1.4 TE缓冲液（pH 2.0） ：取1mol/L Tris-HCl（pH 8.0） 5mL和0.5mol/L EDTA（pH 8.0） 1mL，用 盐酸(HCl)调pH至2.0，加蒸馏水定容至500mL，高压灭菌。 A.1.5 DNA提取液：取NaOH 2g，先用200 mL蒸馏水溶解，再加水定容至500 mL，高压灭菌。 A.2 PCR扩增试剂配制 A.
14、2.1 dNTPs：用超纯水分别配制ATP、GTP、CTP、TTP终浓度为100mmol/L的储存液，各取20L混合， 加入720L超纯水定容至终浓度2.5mmol/L。 A.2.2 SSR引物：用超纯水分别配制左引物（L）和右引物（R）终浓度均为40mol/L的储存液，等体 积混合成20mol/L。 A.3 凝胶与电泳试剂配制 A.3.1 6倍加样缓冲液：取去离子甲酰胺49mL，加入0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）1mL，溴酚兰0.125g， 二甲苯青FF 0.125 g，混匀。 A.3.2 10倍TBE缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）108g ，硼酸 55g，加适量去离
15、子水溶解后， 再加入0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）37mL，加水定容至1000mL。 A.3.3 40% PA胶：取丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g，先用400 mL去离子水溶解后，再加水定容至 500mL。 A.3.4 4.5% PA胶：取尿素450 g， 加入10倍TBE缓冲液100 mL和40%PA胶112.5 mL，加去离子水定容至 1000mL。 A.3.5 亲和硅烷（Binding Silane）缓冲液：取无水乙醇49.75 mL和冰醋酸250L，混合。 A.3.6 0.5%亲和硅烷（Binding Silane） ：在9.95 mL亲和硅烷缓冲液加入50L亲和
16、硅烷原液，混匀。 A.3.7 25过硫酸铵：取0.25g过硫酸铵，加1 mL去离子水溶解，现用现配。 A.3.8 1倍TBE缓冲液：取10倍TBE 500mL，加4500mL去离子水混匀。 A.4 银染试剂配制 A.4.1 固定液：取冰醋酸100 mL，加去离子水定容至1000 mL。 A.4.2 染色液：取硝酸银 2 g，加去离子水定容至1000 mL。 A.4.3 显影液：取氢氧化钠30 g和甲醛5 mL，加去离子水定容至1000 mL 。 DB11/T 5072007 5 附 录 B （资料性附录） 常用的 SSR引物 表 B.1 玉米品种纯度检测常用的 SSR 引物 编号 引物名称 引
17、物序列 1 bnlg439 左引物（L）: 5-TTGACATCGCCATCTTGGTGACCA-3 右引物（R）: 5-TCTTAATGCGATCGTACGAAGTTGTGGAA-3 2 bnlg161 左引物（L）: GCTTTCGTCATACACACACATTCA-3 右引物（R）: ATGGAGCATGAGCTTGCATATTT-3 3 bnlg125 左引物（L）: GGGACAAAAGAAGAAGCAGAG-3 右引物（R）: GAAATGGGACAGAGACAGACAAT-3 4 bnlg198 左引物（L）: GTTTGGTCTTGCTGAAAAATAAAA-3 右引物（R）:
18、 GCTGGAGGCCTACATTATTATCTC-3 5 bnlg238 左引物（L）: CTTATTGCTTTCGTCATACACACACATTCAT-3 右引物（R）: GAGCATGAGCTTGCATATTTCTTGTGG-3 6 bnlg240 左引物（L）: AAGAACAGAAGGCATTGATACATAA-3 右引物（R）: TGCAGGTGTATGGGCAGCTA-3 7 bnlg107 左引物（L）: GCAACTAGAAGTAGATGGCTTGTTATGG-3 右引物（R）: CAACAACAAGTGGCTGGCTAGGGTGAA-3 8 phi034 左引物（L）: T
19、AGCGACAGGATGGCCTCTTCT-3 右引物（R）: GGGGAGCACGCCTTCGTTCT-3 9 phi053 左引物（L）: CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGAC-3 右引物（R）: AACCCAACGTACTCCGGCAG-3 10 phi056 左引物（L）: ACTTGCTTGCCTGCCGTTAC-3 右引物（R）: CGCACACCACTTCCCAGAA-3 11 phi065 左引物（L）: AGGGACAAATACGTGGAGACACAG-3 右引物（R）: CGATCTGCACAAAGTGGAGTAGTC-3 12 phi072 左引物（L）:
20、ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTT-3 右引物（R）: ACAGCGCGCAAATGGATTGAACT-3 13 phi080 左引物（L）: CACCCGATGCAACTTGCGTAGA-3 右引物（R）: TCGTCACGTTCCACGACATCAC-3 14 phi085 左引物（L）: AGCAGAACGGCAAGGGCTACT-3 右引物（R） ： TTTGGCACACCACGACGA-3 15 phi96100 左引物（L）: AGGAGGACCCCAACTCCTG-3 右引物（R）: TTGCACGAGCCATCGTAT-3 16 umc1061 左引物（L
21、）: AGCAGGAGTACCCATGAAAGTCC-3 右引物（R）: TATCACAGCACGAAGCGATAGATG-3 17 bnlg 233 左引物（L）: TCTGATATCATAAAGGAGGACCG-3 右引物（R）: GGAGCTTGCGCTTTTTAACA-3 18 umc2084 左引物（L）: ATCGCGACGAGTTAATTCAAACA-3T 右引物（R）: TACGATGTCTTCAGTGTGACACCA-3 19 bnlg1450 左引物（L）: ACAGCTCTTCTTGGCATCGT-3 右引物（R）: GACTTTGCTGGTCAGCTGGT-3 20 b
22、nlg1940 左引物（L）: 5CCTTTTGTTTCAGGCCGTTA-3 右引物（R）: CAGCAGCCTGATGATGAACA-3 DB11/T 5072007 6 表 B.2 玉米品种真实性鉴定常用的 SSR 引物 编号 引物名称 引物序列 1 bnlg125 左引物（L）: 5-GGGACAAAAGAAGAAGCAGAG-3 右引物（R）: 5-R:GAAATGGGACAGAGACAGACAAT-3 2 bnlg439 左引物（L）: 5-TTGACATCGCCATCTTGGTGACCA-3 右引物（R）: 5-TCTTAATGCGATCGTACGAAGTTGTGGAA-3 3
23、phi072 左引物（L）: 5-ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTT-3 右引物（R）: 5-ACAGCGCGCAAATGGATTGAACT-3 4 bnlg162 左引物（L）: 5-ACTAGCAGCAGTAAAACCTAATAAAGGGA-3 右引物（R）: 5-CAAGTAGCTAGCAGTCATTTGCAGTGT-3 5 bnlg161 左引物（L）: 5-GCTTTCGTCATACACACACATTCA-3 右引物（R）: 5-ATGGAGCATGAGCTTGCATATTT-3 6 bnlg198 左引物（L）: 5-GTTTGGTCTTGCTGAAAAATA
24、AAA-3 右引物（R）: 5-GCTGGAGGCCTACATTATTATCTC-3 7 phi116 左引物（L）: 5-GCATACGGCCATGGATGGGA-3 右引物（R）: 5-TCCCTGCCGGGACTCCTG-3 8 phi123 左引物（L）: 5-GGAGACGAGGTGCTACTTCTTCAA-3 右引物（R）: 5-TGTGGCTGAGGCTAGGAATCTC-3 9 phi065 左引物（L）: 5-AGGGACAAATACGTGGAGACACAG-3 右引物（R）: 5-CGATCTGCACAAAGTGGAGTAGTC-3 10 umc1040 左引物（L）: 5
25、-CATTCACTCTCTTGCCAACTTGA-3 右引物（R）: 5-AGTAAGAGTGGGATATTCTGGGAGTT-3 11 umc1944 左引物（L）: 5-GAAGAAGGATCGCACACATGG-3 右引物（R）: 5-AGACTGTCGCGCTGTACTATACCC-3 12 phi077 左引物（L）: 5-GAGAAGAGGATCAGGTTCGTTCCA-3 右引物（R）: 5-CGCGTTGTACATCTTGCCTGCTT-3 13 bnlg240 左引物（L）: 5-AAGAACAGAAGGCATTGATACATAA-3 右引物（R）: 5-TGCAGGTGTA
26、TGGGCAGCTA-3 14 bnlg238 左引物（L）: 5-CTTATTGCTTTCGTCATACACACACATTCAT-3 右引物（R）: 5-GAGCATGAGCTTGCATATTTCTTGTGG-3 15 phi085 左引物（L）: 5-AGCAGAACGGCAAGGGCTACT-3 右引物（R）: 5-TTTGGCACACCACGACGA-3 16 umc1196 左引物（L）: 5-CGTGCTACTACTGCTACAAAGCGA-3 右引物（R）: 5-AGTCGTTCGTGTCTTCCGAAACT-3 17 bnlg1006 左引物（L）: 5-GACCAGCGTGT
27、TGATCCC-3 右引物（R）: 5-GAGACCCCGACTCTCTCTC-3 18 bnlg1621 左引物（L）: 5-CTCTTCGATCTTTAAGAGAGAGAGAG-3 右引物（R）: 5-ACACGAGGCACTGGTACTAACG-3 19 phi295450 左引物（L）: 5-CCTTTTCATGTTGCTTTCCC-3 右引物（R）: 5-GCCCAATCCTTCCTTCCT-3 20 phi053 左引物（L）: 5-CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGAC-3 右引物（R）: 5-AACCCAACGTACTCCGGCAG-3 DB11/T 5072007
28、 7 表B.2 （续） 编号 引物名称 引物序列 21 umc1904 左引物（L）: 5-CAGCCACTCGTTTATGGAGGTTTA-3 右引物（R）: 5-TGTTACTAGTCGATCTGATGCCCA-3 22 phi048 左引物（L）: 5-GCAAACCTTGCATGAACCCGATTGT-3 右引物（R）: 5-CAAGCGTCCAGCTCGATGATTTC-3 23 phi080 左引物（L）: 5-CACCCGATGCAACTTGCGTAGA-3 右引物（R）: 5-TCGTCACGTTCCACGACATCAC-3 24 phi099 左引物（L）: 5-TACAAA
29、AATCAGGACTGCGAAAAACCCAA-3 右引物（R）: 5-GTCGGTGTGTGATCCTTCCAC-3 25 phi015 左引物（L）: 5-GCAACGTACCGTACCTTTCCGA-3 右引物（R）: 5- ACGCTGCA TTCAA TTACCGGGAAG-3 26 phi037 左引物（L）: 5-CCCAGCTCCTGTTGTCGGCTCAGAC-3 右引物（R）: 5-TCCAGATCCGCCGCACCTCACGTCA-3 27 bnlg1306 左引物（L）: 5-CACCTTGAAAGCATCCTCGT-3 右引物（R）: 5-CAAAAACAAATGGC
30、AGCTGA-3 28 bnlg1505 左引物（L）: 5-GAAAGACAAGGCGAAGTTGG-3 右引物（R）: 5- GCTTCTGAACTGGATCGGAG-3 29 bnlg1884 左引物（L）: 5-TTCGGATGCATGTGTAACGT-3 右引物（R）: 5-CGGAAGTCCCATCTGTTTGT-3 30 umc2105 左引物（L）: 5-ACATACATAGGCTCCCTTTTTCCG-3 右引物（R）: 5-TCCCGTGACACTCTCTTTCTCTCT-3 31 phi047 左引物（L）: 5-GGAGATGCTCGCACTGTTCTC-3 右引物（R
31、）: 5-CTCCACCCTCTTTGACATGGTATG-3 32 bnlg2291 左引物（L）: 5-CCTCTCGATGTTCTGAAGCC-3 右引物（R）: 5-GTCATAACCTTGCCTCCCAA-3 33 umc1822 左引物（L）: 5-GGTATAATTTTGCAAGCAGAAAGGG-3 右引物（R）: 5-GGTTTGCTCAGGAAGAGCATGT-3 34 bnlg1401 左引物（L）: 5-CACTCGGTTTTTGCTTAGCC-3 右引物（R）: 5-GTGTCGTCGAGTGCATGC-3 35 nc004 左引物（L）: 5-TGCGAAGAAGC
32、AGTAGCAAA-3 右引物（R）: 5-TGGAGGTAGAAGACGCACG-3 36 phi115 左引物（L）: 5-GCTCCGTGTTTCGCCTGAA-3 右引物（R）: 5-ACCATCACCTGAATCCATCACA-3 37 umc1562 左引物（L）: 5-CAAAGCAGTACAATATGACCCCAG-3 右引物（R）: 5-CGTACGTCCCATAAAGATGAGAAA-3 38 bnlg1450 左引物（L）: 5-ACAGCTCTTCTTGGCATCGT-3 右引物（R）: 5-GACTTTGCTGGTCAGCTGGT-3 39 umc1294 左引物（L）: 5-GCCGTCAACGGGCTTAAACT-3 右引物（R）: 5-GCCTCCAGCTCTCTCGTCTCTT-3 40 umc1970 左引物（L）: 5-ACTGATGGTGTTCTTGGGTGTTTT-3 右引物（R）: 5-TTTTTACCCGAAGGTTCATCGTTT-3
