1、ICS 67.120.30 B 52 备案号： 19162-2006 北 京 市 地 方 标 准 DB DB11/T 371 2006 鳄龟 American Snapping Turtle 2006-07-25发布 2006-10-01实施 北京市质量技术监督局 发布 DB11/T 3712006 I 前 言 本标准的附录 A为规范性附录。 本标准由北京市农业局提出并归口。 本标准起草单位：北京市水产技术推广站。 本标准主要起草人：杨华莲、张黎、潘志、宣庭孝、高南、赵睿。 DB11/T 3712006 1 鳄 龟 1 范围 本标准规定了鳄龟（ Chelydra Serpentina）的主要生
2、物学特性、肌肉营养成分分析、细胞遗传 学特性、生化遗传学特性、分子遗传学特性，以及检测方法。 本标准适用于鳄龟的种质鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款 通过 本标准的 引 用而 成为本标准的条款。 凡是注日期 的 引 用文件， 其随后所有 的修改 单（ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不 适用于本标准， 然而， 鼓励根据 本标准达成 协议 的 各方研 究是否可使 用这些 文件的最新版本。 凡是不注日期的 引 用文件， 其最新版 本适用于本标准。 GB/T 5009.3-2003 食品 中水分的测定 GB/T 5009.4-2003 食品 中灰 分的测定 GB/T 5009.5-200
3、3 食品 中蛋白质的测定 GB/T 5009.6-2003 食品 中脂肪的测定 GB 17718-1999 鳙 GB/T 18654.2 养 殖鱼类种质检验 第2 部分： 抽样方法 GB/T 18654.12-2002 养 殖鱼类种质检验 第12部分：染色体组型 分析 3 名称与分类 3.1 学名 鳄龟（ Chelydra Serpentina ） 3.2 分类位置 鳄龟科（ Chelydridae） ,鳄龟 属 （ Schweigger），鳄龟（ Chelydra Serpentina ）。 4 主要生物学特性 4.1 外部形态特征 4.1.1 外形 头伸出 体外， 不能缩入甲壳内， 上下
4、颌略尖 ，眼圆。 尾长而尖 ，尾两侧有肉 突，尾背前 2/3处有一 条鳞皮状隆 起， 呈 锯齿 状 ， 皮呈褐色。 被壳 薄而 坚 ， 边缘 有许多齿 状突起， 腹 甲 小， 腹 部 淡黄色或浅褐 色。 前后爪较长， 趾间具蹼 ，四肢较 长 且发 达 粗壮。 背部 由 13枚-15 枚 背甲组成，有3 条模糊棱 。 鳄龟正面图见图 1，腹面图见图2 。 DB11/T 3712006 2 图 1 鳄龟正面图 图 2 鳄龟腹面图 (1)吻 (2)颈 (3) 前 肢 (4) 背甲 (1) 吻 (2)下 颌 (3) 颈 (4)前 肢 (5) 背甲 缘盾 (5)后 肢 (6)爪 (7) 尾 (6)后 肢
5、 (7) 爪 (8)尾 (9) 腹 甲 4.1.2 可数性状 椎盾：5 ， 颈盾 ：2 ， 肋盾 ：8-10， 缘盾 ：22， 臀盾：2 ， 喉盾：2 ，肱盾 ：2 ， 胸盾 ：2 ， 腹盾： 2， 股盾： 2， 甲 桥 ： 6， 腋盾：2 ， 侉盾 ：2 ， 肛盾：1-2 。 4.1.3 可量性状 不同年龄 组 的鳄龟 背甲、 腹甲长和宽 的 实测 值见表1 。 表 1 不同年龄组鳄龟背甲、腹甲长和宽的实测值（单位： cm） 组 别 项目 1龄 2龄 3龄 4龄 背甲长 13.44 0.49 16.90 0.35 20.100.85 22.70 0.56 背甲 宽 11.56 0.65 16
6、.80 0.67 21.600.84 22.70 0.73 腹 甲长 10.65 0.52 12.10 0.53 13.800.72 16.00 0.58 腹 甲 宽 10.58 0.63 15.00 0.64 17.700.65 20.80 0.74 4.2 内部构造特征 4.2.1 脊柱骨 颈椎8 枚，胸椎10 枚，荐椎2 枚 ， 尾椎20枚。 4.2.2 消化道 全口无齿 ，口裂有角质化 硬鞘 。 食道 细 而长，胃较宽大，小肠盘曲位于 十二指肠 后 。 4.2.3 消化腺 由肝、 胰和胆等组 成。 肝深褐色 且较大，分 左右 两 叶 ， 胆囊在肝叶中， 胰腺乳黄 色 紧靠十二指肠 。
7、4.2.4 肺 扁平长圆 囊 状， 2叶 。 鳄龟的 内部 结构图见图 3。 DB11/T 3712006 3 （ 1） 气管 （2 ）食 道 （3 ）心脏 （ 4） 肝脏 （ 5） 胃 （6 ）胰 脏 （ 7） 肺脏 （ 8） 胆囊 （ 9） 卵巢 （ 10）小肠 （11 ） 膀胱 （12 ） 脾脏 （ 13）输卵管 （ 14） 肾脏 （ 15） 泄殖 腔 （ 16）副膀胱 （ 17）泄 殖 腔孔 图3 鳄龟（雌 性）内部结构图 4.3 生长 不同年龄 组 鳄龟的 体重与 体厚 实 测值见表2 。 表2 不同年龄组鳄龟的体重、体厚实测值 组别 项目 1龄 2龄 3龄 4龄 体重 （ g） 9
8、26.40 100.42 1200120.52 1900 145.38 2700 210.45 体厚 （ cm） 6.89 0.40 7.3 0.53 9.8 0.41 11.20.40 4.4 繁殖 4.4.1 性成熟年龄 3龄 -4龄。 4.4.2 繁殖季 节 4月 -6月。 4.4.3 年性成熟 次数 性成熟个 体 性 腺每年成熟 一次 ， 一次 产 卵。 4.4.4 产卵量 每只性成 熟雌龟每年产卵 20枚-80 枚 。 5 肌肉营养 成分 5.1 主要 营养 成分 鳄龟肌肉 蛋白质、粗脂肪 、灰 分、水分等营养 含量指 标 见表 3。 DB11/T 3712006 4 表3 肌肉（
9、后肢基部）主要营养 成分 检测 项目 营养 指标（ %） 粗蛋白 19.32 粗脂肪 0.40 灰 分 0.88 水分 77.9 5.2 氨基酸含 量 表4 肌肉（ 后肢基部）主要营养 成分 检测 项目 氨基酸含量 （% ） 天门冬氨酸 1.65 苏氨酸 0.86 丝氨酸 0.83 谷氨酸 2.95 甘氨酸 1.00 丙氨酸 1.10 胱氨酸 0.20 缬氨酸 0.88 蛋氨酸 0.52 异亮氨酸 0.85 亮氨酸 1.45 酪氨酸 0.68 苯丙氨酸 0.71 赖氨酸 1.52 组氨酸 0.60 精氨酸 1.10 氨基酸 （以 鲜基计） 总量 17.68% 脯氨酸 0.78 6 细胞遗传 学
10、特性 6.1 体 细胞染色体 2倍数 2n=52 6.2 核型公式 12m+4sm+6st+2t+28cm NF=68 6.3 染色 体组 型 鳄龟染色体中 期分裂相见图 4 ， 染色体组型 见图 5。 DB11/T 3712006 5 图 4 染色 体 中期 分裂相 图 5 染色体组型 7 生化 遗传学特性 肌肉的 乳酸脱氢酶（ LDH） 同 工酶有 8条 谱带； 肝 脏 的 酯酶（ EST） 同 工酶 有5 个基因座位， 有 5条谱 带。 肌肉的 乳酸脱氢酶（ LDH）同 工酶电泳图谱见图 6。 肝脏的 酯酶 （ EST）同工酶电泳图谱 见图7 。 图 6 肌肉 的 乳酸脱氢酶 （LDH
11、）同 工酶电泳 图谱 图 7 肝脏的 酯酶 （ EST）同 工酶电泳图谱 8 分子遗传 学特性 用20个 RAPD（ 随 机扩增 多 态 性DNA 技术， 又称任意引 物 PCR）引 物对 其 基因组 DNA进行 分析，确认 引 物S 19 的分析结果能够反应其 基因组的多态 性特征。引物S 19序 列：tgcccgtcgt见图 8。 O O Est-5 Est-4 Est-3 Est-2 Est-1 DB11/T 3712006 6 图 8 基因 组 DNA RAPD图 谱 M：分子 量标准 C：对照 样品 G：鳄龟 样品 （ 4个 样品 ） 9 检测方 法 9.1 生物学性状测 定 参照G
12、B 17718 规定的方法测定。 9.2 肌肉营养 成分测定 9.2.1 样品制 备 取活体后 肢 基 部肌肉，于 105烘干， 粉碎 。肌肉 各成分测定 按照GB/T 5009.3 、 GB/T 5009.4、 GB/T 5009.5、GB/T 5009.6 规定的方法 进行。 9.2.2 氨基酸 取活体后 肢 基 部肌肉，于 105烘干， 粉碎 。肌肉 各成分测定 按照GB/T 5009.3 、 GB/T 5009.4、 GB/T 5009.5、GB/T 5009.6 规定的方法 进行。 9.3 细胞遗传 学特性检测 根据GB/T 18654.12 的相关规定进行 。 9.4 生化 遗传
13、学性状分析 9.4.1 样品制 备 样品加 3%辅 酶 I液匀浆 ，低温离心， 至上清液澄清。整个制备 过 程 均在低温下 操作 。 9.4.2 电泳分 析 使用水 平淀 粉 凝胶电泳仪 。 淀粉胶浓度为 10%， 酯酶 （EST ） 电泳缓冲液为 三羟甲基氨基 甲 烷 （ Tris） -硼酸- 乙二胺四乙 酸 四 钠盐， 乳 酸脱氢酶 （LDH ） 电泳缓冲液 为 甲 基氨基 甲 烷 （ Tris） -柠檬酸， pH值7.0 。 将10% 浓度 水解淀粉煮好 后倒入制胶 模 内 ，待凝固后，切一 横裂 缝，用滤纸片吸取 样品的上清液插 入裂 缝中。 电泳电压 为250V， 电泳 8h-10h
14、， 电泳恒温4 ， 电泳 后横切成0.2cm 左右 的 薄片， 浸 入染色液中 保 温染色 。同工酶染色液配 方见附录A 。 9.4.3 结果判定 将测定 结果对照图6 、7 谱带确定 该种 同 工酶 的编码座 位 数和多 态座 位的 基因数。 9.5 分 子遗传 学特性分析 9.5.1 基因组 DNA的提取纯化 DB11/T 3712006 7 取肌肉 剪碎用 组织 列 解液（ 0.5mol EDTA，PH值 8.0； 200g/mL ProteinnseK ； 0.5% Snrcosyl） 于55 消化过夜， 次 日用酚、 氯仿、 异戊醇 （ 24： 24： 1） 抽提 三 次， RNas
15、eA消 化 去除 RNA后再 抽提 一 次 ， 然后 用2150mmol/L Tris. HCl(pH 8.0) 、 10 mmol EDTA（ pH 8.0），透析至 OD2700.05，检测DNA 浓度 ， 置4 保存备用。 9.5.2 RAPD 引物及扩增条 件 用PE-9600 型 PCR扩增仪 ， RAPD扩增 引物OPP 及OPM 组 计15个 。 RAPD反应： 10mmol/L Tris.HCl （pH 8.3 ）， 50 mmol/L KCl，2.0 mmol/L MgCl 2， 0.001%明胶； Dapt.dGTP、Dctp， dTTP各 为0.1 mmol/L: 引物
16、15 g， 基因 组DNA 20 g ，1 单位 Tag聚合酶 。于 93.5 变性1min ，36 退火1min， 72 延伸2min，计 45个循 环， 循环结束后延 伸5min，扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳 检测。 9.5.3 琼脂糖凝胶电泳 凝胶浓度 为1.5%的 琼 脂糖 ， 胶中含0.5g/mL 溴 化乙锭。 电泳 缓冲液为 TBE， 电泳在 室温 下 进行， 电压 为15V ， 电泳 时 间为16h 。电泳毕在紫 外 灯 下观察拍照 。 10 检测规 则 10.1 检测分类 检测分为鉴定检测 和质量 一致 性检测。 10.2 检测 项目 鉴定检测 项目包括外部形 态特 征
17、、 可量性状、 可数 性 状 。质 量一 致性检测项目包括 细胞遗传学特性、 生化遗传学特性、分子遗传学特性。 10.3 取样 样品龟的 抽样按GB/T 18654.2规定 执行 。 10.3.1 组 批 以同龄 期的鳄龟为同一批。 10.4 判定 规定 各项检 验指 标 在标准范围 内则判定为鳄龟良 种。 DB11/T 3712006 8 附 录 A （规范性 附录 ） 同工酶染色液配 方 A.1 酯酶染色液配 方 酯酶 染色 液配 方 见表 A.1 表 A.1 酯酶染色液配方 - 乙 酸萘 酯 （ mg） 坚牢蓝 B盐 （mg ） 三羟 甲基氨基 甲烷- 柠檬 酸缓冲液 （ 1mol，PH 7.0 ）(mL) 蒸馏 水(mL) 40 100 10 10 A.2 乳酸脱氢酶染色液配 方 乳 酸脱氢酶染色 液配方见表 A.2。 表 A.2 乳酸脱氢酶染色液配 方 乳酸 钠(mL) 辅酶I(mg) 氮蓝 四唑(mg) 吩嗪 甲硫 酸(mg) 三羟 甲基氨基 甲烷- 柠檬 酸缓 冲液 （1mol ，PH 8.6 ）(mL) 蒸馏 水 (mL) 0.5 6 2 1 10 10
