1、DB河北省地方标准玉米杂交种及自交系、小麦种子纯度检验方法一一蛋白质电泳法D B13/ T221一941994-11-21发布_1994一12一01实施河北省技术监督局发布河北省地方标准玉米杂交种及自交系、小麦种子纯度检验方法一一蛋白质电泳法D B13/T221-94主题内容与适用范围本标准规定了蛋白质电泳技术快速测定种子纯度原理和试验方法。本标准适用于玉米杂交种、玉米自交系和小麦种子。2引用标准GB8170数值修约规则GB3543农作物种子检验规程3术语3.1特征蛋白质，某一品种的作物种子所含有的特定的不同于该作物其它品种的基因，该基因所决定的蛋白质也就不同于其它品种的蛋白质，因此定为特征蛋
2、白质。3.2纯度本品种的种子粒数占供检样品总数的百分率即为供检品种纯度。4原理将玉米或小麦种子贮存蛋白质利用电泳技术进行分离，得到蛋白质指纹图，根据玉米或小麦品种的特征蛋白质进行品种鉴定，然后计算出纯度。5试验方法5.1仪器设备5.1.1稳压稳流电泳仪0-600 V 0 .200m A5.1.2双板夹心电泳槽5.1,3高速离心机:最高转速为1600。转/m in5.1.4天平，称量2009，分度值10mg5.1.5微量进样器0-50 P15.1.6注射器02ml5.1.7 50ml锥形瓶5.1.8带盖搪瓷盘5.1.9移液管0-10ml河北省技术监.局1994-11-21批准1994-12=01
3、实旅一1一DB13/T221-945.1,10吸液器0 -10m15.1.11医用X光片观察仪5.1.1Q可调徽最取样器0-1“200”15.1.13 1,5ml离心管、吸液尖5.1.14液体快速混合器5,2试剂和材料5,2.1 30肠丙烯酸胺(Acry)-N-N一甲叉双丙烯醉胺(Bis)母液称取150.OOg A cry.和4.OOgB is，溶于300M I热蒸姗水中，趁热过滤，并定容到500m 1,低温保存(0-4OC)(5.2.2, 5.2.3, 5.2.4, 5.2.5保存条件相同)5.2.2 1090过硫酸钱称取1.009过硫酸钱，溶于l Om】水中5.2.35.2.4TEMED:
4、用原液蛋白质提取液9.00g SUP溶于150m 1水中5.2.5 1肠甲基绿指示剂1.009甲基绿溶于少许乙醇，然后加入I OOM 150呱的甘油溶液，摇匀即可。5.2.6阳极室电泳液:吸取4ml乳酸溶于500m 1水中。5.2.7阴极室电泳液:称量3.009Tr is，并吸取2ml乳酸溶于500 m 1水中。5.2.8脱色液乙醇:冰乙酸:水=20 e 7 : 73SA.9 0.5呱的考马氏亮蓝R250染色液1.009考马氏蓝溶于少许乙醇，加入200M I脱色液即可(染色时稀释10倍)5.3试验步骤5.3,1扦样扦样及平均样品的制备，按GB3543执行。5.3,2样品制备5.3,.2.1从做
5、完净度后的种子中，随机取试样2-4份，每份100位，逐位粉碎后(粉碎粒度!mm)目t公确.。二，t口11 -),V,、i*r _ trC闷，5,3.2.2吸取。.35ml蛋白质提取液，顺次加入离心管，然后将离心管放入液体快速混合器中，IOm in，振荡完毕，将离心管转入离心机，在1000。转/m in的条件下离心15m in,样。振荡上清液即可用于点5.3.3装模具将两块平板玻璃装入橡胶封条内，线，通过电泳槽上的紧固螺丝，然后转移到电泳槽上，使较高的玻确板向外，调按好封条故密封热琼脂，待热琼脂凝固后，将玻璃固定好。在较高玻璃板与电泳槽形成的凹槽内加入适量的1肠的两块玻璃板之间就形成一个三侧封闭
6、的空间，这就是凝胶胶室。4配制胶液分离胶中A cry的浓度一般在1250-20%之间，中每5m1含有0 .509为SUP.成层胶的浓度一般在4肠一6呱之间，含有0.509SUP,根据实验所需的浓度及体积进行配制，分离胶液根据试验所需的浓度及体积进行配制，每5ml成层胶液中5.3.55,3:5制备凝胶将配好的分离胶液摇匀，按每15m 1分离胶液加入50妇109b硫酸胺及30曰TEMED的比例一2一加入这两种液体，摇匀后，将胶液缓缓加入胶室内，待液面离矮玻璃2 cm时，停.止灌胶，用注射器吸取I ml左右的蒸馏水，沿着胶室的一侧轻轻注入，使胶液上层形成一薄水层。5.3.5.2待分离胶聚合后吸去水层
7、，并用成层胶液冲洗胶面1一2次，然后以每5ml成层胶胶液中加丫40口10 QIo的过硫胺及30妇的TEMED的比例。加入，摇匀后，注入分离胶的上部，待到液面离矮玻璃板2mm时，停止灌胶，插入“梳子”(注意不要让梳子的齿部产生气泡)成层胶聚合后，快速拔了梳子，如果加样槽不规则，可以用长针头进行修正，这样凝胶制备完毕。5.3:6加样将可调微量取样器调到10 t l，逐管取上清液顺次加入加样槽内，加完样后，在样品槽中加入适量的阳极室电泳液( PH=2.4的乳酸溶液)然后用琼脂密封加样槽，至此加样完成。5 3.?电泳在两侧的电极室中加入PH值8.2的乳酸-Tr is级冲液(阴极室电泳液)，并接电泳仪的
8、负极，中间的电极室中加入PH值2.4的乳酸溶液，接电泳仪的正极，采用稳压方式接通电源，开始时电压稳定在100V左右，在加样槽的正上方加入甲基绿指示剂，待到甲基绿在分离胶中形成一条直线时，将电压加大到250V左右，待到指示剂运动到凝胶底部时，关闭电源，取出凝胶。5.3.8染色及脱色胶片取出后放入有。,05肠的考马氏亮蓝染色液的瓷盘中进行染色，一般室温下染色2h，然后转入脱色液(乙醇:乙酸:水=7.0 0 7:73)中进行脱色，直到背景无色或淡蓝色为止。6试验结果及计算石.1试验结果将胶片放在X光片观察仪上进行观察，根据供检品种蛋白质的特征谱带进行逐粒鉴定，并数出异品种的粒数。6.2纯度计算按以下
9、方法计算出品种纯度纯度肠=供检种子粒数一异品种的种子粒数供检种子粒数X 1006.3两份试样的检验结果之间的允许误差见下表:TAAI (90 )99.00-100一Rix ( 0k )197.00-98.99卜一2一一-95.00-96.99卜一一3一一一-90.00-94.99卜一一一生一一一85.00-36.99卜一5一一一.一70.00-84.99-一一卫-一-一一70竺一一_一8一3一如果两份试样的误差超过允许范围，则需要再做两个平行样品，最后以四次试样结果的算术平均值，为最终结果。6，4数值修约计算结果修约到小数点后二位。数值修约按GB817。的规定进行。附加说明.本标准由河北省技术监督局提出;本标准由河北省农产(商)品质量监督检验站起草;本标准主要起草人牛占旗;本标准产由河北省农产(商)品质量监督检验站负责解释。一4一
