1、 河北省地方标准实验动物全价营养饲料标准DB13/T210一941主题内容与适用范围本标准规定了实验动物全价营养饲料的技术要求、测定方法、检验规则、标志，包装、运输和储存。本标准适用于大鼠、小鼠、地鼠、豚鼠、家兔、犬、猫等实验动物用饲料。2引用标准2.1原料标准GB10363-10368饲料用玉米、高梁、稻谷、小麦、皮大麦、小麦鼓原料标准GB10383饲料用黑大豆原料标准GB 10384饲料用大豆原料标准GB 10389饲料用首楷草粉原料标准GB10397饲料用大豆饼标准2.2测定方法标准GB6432饲料粗蛋白测定方法GB6433饲料粗脂肪测定方法GB6434饲料粗纤维侧定方法GB6436饲料
2、水分测定方法GB6436饲料钙测定方法GB6437饲料总磷量测定方法GB6438饲料灰分侧定方法GB6439饲料水溶性氯化物测定方法GB13079饲料中砷的测定方法GB13080饲料中铅的测定方法GB 13081饲料中汞.的测定方法GB13086饲料中亚硝酸盐测定方法GB13090饲料中六六六、DDT测定方法GB6009. 22黄曲霉毒素B侧定方法GBb009. 20有机磷农药残留量侧定方法、河幼j省技术监粉局1994-03-281肚准1994-04-01实施.一升-一、-DBJ 13T210-94一一一一一一一一一一一一一一一GB4789. 2菌落总数测定方法GB4789. 3大肠菌群侧定方
3、法GB4789. 4沙门氏菌检验方法GB4789. 6病原性大肠艾希氏菌检验方法GB4789. 12肉毒梭菌检验方法2.3饲料标签标准GB106483技术要求饲料标签3.1成品饲料为以天然原粮为主要原料.加工制做成颗粒状，且应整齐均匀，适口性强。3.2成品饲料色泽新鲜一致，无杂质，无异味，无霉变，无发酵，无虫蛀、鼠咬。3.3成品饲料中不得掺人抗生素、驱虫剂、防腐剂、防霉剂、色素、促生长剂以及激素等添加剂。维生素、常量元素、微童元素、氮基酸等添加剂应符合食用要求。3.4成品饲料配方经确定后，须保持其稳定性，不得任意更改其中组分。3.6营养成分指标(见表1)3.6饲料重金属含量及污染物质控制指标(
4、见表2)3.7饲料徽生物控制指标(见表3)4试验方法各项监测项目，按国家标准方法进行，粗蛋白按GB6432执行，粗脂肪按G.B6433执行，粗纤维按GB6434执行，水份按GB6436执行，钙按GB6436执行，总磷按GB6437执行，灰分按GB66438执行，水溶性氯化物按GB6439执行，重金属砷、铅、汞分别按GB13079, GB13080. GB13081执行。亚硝酸盐按GB13K执行，六六六、DDT按13090执行，黄曲霉毒素B、按GB6009.22执行，有机磷农药残留量按GB6009. 20执行，菌落总数按GB4789 . 2执行，大肠菌群按GB4789 . 3执行，沙门氏菌按GB
5、4789. 4执行，病原性大肠艾希氏菌按GB4789. 6执行，肉毒梭菌按GB4789. 12执行。无国家标准的按本标准规定的方法测定，见实验动物全价营养饲料监测方法。6检验规则6.1饲料原料按国家有关标准方法进行自检。6.2出厂检验6.2.1以同批原料制作的成品饲料为一批产品，每批成品饲料进行自检。DBI 13T213946.2.2成品饲料检测项目为水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、灰分、钙、磷。5.2.3试样的选取和制备见实验动物全价营养饲料监测方法)6.3型式检验5.3.1每年一次一，由何北省主管部门指定监一测单位，按测定一方祛对成品饲一料取样检侧。6.,3. 2一河北省卖验动物一工作主管
6、部门，不定期妹成品饲料袖样检铡，6.3.3型式检验项目6.3.3.1型式检验项目分禾标准表1,表2、表3中钓各项规定。6.8.3.2新配方成品饲料还应检测本标准附录A中表A1, A2, A3,6.3.:4判定规则成品饲料检测中符.合表1.,表琴、表3各项指标t.合格e品，.不合格产品抓重新取样，对其中不符合规定的指V,进行复检p -in仍不符合规定时，则试产品为不合格产品。新配方成品饲料还应附合本标准附录A中表A1, A2, A3中的各项规定。作为判断的主要参考依据。6标志、包装、运物、贮存6.1标志成品饲料标志应符合GRIFOM的规定。6最产Llp说明、书除成品饲料标志往明事项外，还须说明原
7、A情况、一营养指标、认证编号及硕发单位。6.3包装包装材料必须无毒、无污染、无异味。成品饲料须双层包装，包装须封口严密，无破损。6.4运输成品饲料运翰中须防止包装破损、日晒、雨淋、不得接触有害物质。6.6储存成品饲料与各种原料须分开储存、库房内须干燥、通风、清洁、无虫、无蝇、无野鼠，严禁存放有毒有害物品。6.6保质期成品饲料保质期不超过三个月(雨季不超过二个月)。DB声13T210-94农1首养成分指标实段二种经公钾盛分(%)火。小.泊.肠.盆免犬翻水分一108-10一10e-10.一日6-10粗砚白质1一，1一，41一，01.一公.皿1一，.，o-污，.红.0一1.420.88-1.400.
8、77-0，0.77-0.941日一1.641.60-1。二甘十皿组。，一七100.86-0.80.。47-0。二0.45-0。二0.64-0.0.07-1.04色妞.0.22-0.340.30-0.，.0.33-0.360.21-0.5犷.。，.-0.3。3.一.。汤.粗口.4-6.一3-.a一4-2一皿0粗奸组-.肠一10-1610-16a一a一灰分.一.一，一，-.，-.，一男1.0-1.01.0-11.0-1.61.0-1.1.2-1二1.2-1.4.O:!-1.，6-1.，0.6-1.0.。6-1.00.8-1.00.8-1.0维生众点(L Ul切.哇双D(L叨如】1 1 i0T1Sf
9、i0I 0is舀刃0-16000PGi0I013F1,10007500-1260002000-1350010000-1600012151i01250-1500760-1260750-12502000-45001100-2000.跳公C(Mel如】I ioIe131d 04DB/ 13T210-94表2饲料重金属及污染物质控制指标项目指标mg/ kg0. 02重金属0. 61汞砷铅污染物质黄It霉素BI (Aflato:inB1)亚硝酸盐(Nitrite)六奴化苯(666)(Benzene he:achloride)滴滴涕(DDT)(Dichiorodiphrny-trichloroethane
10、)敌敌畏(Dichlorvos)摇乐果(Dimethate)马拉硫磷(Maiathion)对硫磷(Parathion)甲拌麟(P肺rate)杀螟硫僻(Fenitrothin)倍硫磷(Fenthin)0. 0060. 90. 20.全0. 0630.1 0.0 20. 4几。05农3饲料徽生物控制指标指标项目大且、小成、地巨豚旦、家懊犬、猫细菌总数(个/克)大肠菌群(个1克)致病菌2 x 101 x 10成品饲料不允许有沙门氏菌，炭疽杆菌、肉毒杆菌、病原性大肠艾希氏菌存在注:饲育饲料橄生物指标;经过不同方法稍毒处理.应使其与相应等级的实验动物一致。_DB13/ T210-94_附录A实验动物全价
11、营养饲料监测方法(补充件)A1组基酸测定法A1. 1十六种氮基酸的测定一一氮基酸自动分析仪法A1. 1. 1原理蛋白质经盐酸水解，成为游离纸基酸，再用氮基酸自动分析仪进行侧定。氮基酸自动分析仪是应用离子交换层析的原理进行氮基酸分析。所用树脂一般为Na-型阳离子交换树脂。各种氨基酸的酸碱性、极性和分子大小等性质不同，对树脂的亲合力也不一样，当用不同PH和离子浓度的缓冲液洗脱时，各种奴基酸被洗脱顺序不同，先是酸性氨基酸和极性较大的氮基酸，其次是非极性的和芳族氮基酸，最后是碱性氮基酸被洗脱，分子量小的比分子量大的先被先脱，从而达到分离的目的。被洗脱的氨基酸与苟三酮溶液产生颜色反应，可通过分光光度计比
12、色测定各个氨基酸含it。一份水解液可同时测定天冬、苏、丝、谷、脯、甘、丙、绷，蛋、异亮、亮、酪、苯丙、组、赖、精氨酸等16种甄基酸。A1. 1. 2仪器氨基酸自动分析仪电热减压燕发器(见图1)图1电热减压燕发器1.调压变压器;2.J(空干澡器.有加热炉丝:8.压力表;4.级冲瓶;6.内装饱和氢暇化钠;.内装抓化钙水解用试管.18X 180mm硬质玻璃管(见图2)。在距管口20. 30mm处拉细，便于封管烘箱。一一一一一一一DH1317210-94一一一一Al. 1.3试剂a. 6N盐酸1份优级纯浓盐酸(比重1.19)加1份重燕馏水。b,酚须重燕馏后使用。c.高纯氮含量99.999% eA1.
13、1. 4测定步骤Al. 1.4.1样品水解a、称取一定量样品到试管中(也可用带密封垫的螺丝盖管代替试管)，使样品含蛋白质在10-r 20m g范围内。b、对固体样品可加人6N盐酸16m1，对液体样品可加人与样品等体积的浓盐酸。c、加人新燕馏的酚2-3滴。d、将试管置于冰盐、混合浴中，冰冻3-r 6min，用真空泵抽空到1.33-2.66kPa(10-,- 20mmHg)，然后充人氮气，重复3次。在试管的细颈处用火焰封口一边抽真空一边封管，注意在操作时勿使样品接触管口加热部分。f、将样品管置于烘箱中，于110水解22h,g.取出样品管用冷水冷却后切开试管，将水解液经滤纸过滤到60m 1容量瓶中，
14、用重蒸馏水淋洗试管及滤纸并定容。h.取样品滤液lml到6ml小容量瓶中，将瓶置于减压燕发器内在36 C减压燕干，用lml重蒸馏水冲洗瓶壁，再抽干，如比反复3次。i、加适量(1-2m1)0.02N稀盐酸(pH2. 2)将燕干之样品溶解即可上机分析，若不立即进行分析，可在4短期存放Al. 1.4.2上机分析根据不同型号仪器选择合适的参数进行氨基酸分析。.将16种氨基酸标准混合液上机，得到标准氨基酸的出峰时间及峰面积，根据样品出峰时间可以鉴定样品中氨基酸的种类，将样品峰面积与标准对比，计算样品中各种氮基酸含t-A1.1.6计算上机样品液(50u 1)中氮基徽总f (nmol)-上机标谁摘(。”1)中
15、组malt(umol)X祥品姆面积1组基曲标准娜面积1008祥品中组基吸二盆一上机样品摘中组基.总f(二ol)x (Dx Idx 100)/(W X Bx 10)式中:一.-一.一DB13/210-94一一一一一一一一一一一一一一D:样品的稀释倍数。M:氮基酸分子童(ng) ow:样品重量(g) eE:上机时的进样量(此处为60p 1) ,Al. 2胧氮酸的测定一一过甲酸氧化，氨基酸自动分析仪法Al.2.1原理在用盐酸水解蛋白质的过程中，脱氮酸易被破坏，现多采用过甲酸氧化法将蛋白质中的就氮酸及半脱氮酸氧化成半耽确酸。其反应式如下:OllwHNH:CH:一CH一COOH+半耽技酸3H一C一OOH
16、-P-过甲酸O.S03 NH，CH:一C一COOH+半耽磺酸3H一C一OH甲酸生成的半肮磺酸可在氮基酸自动分析仪上进行测定.与标准半耽磺酸比较，计算其含童。Al.2.2仪器水解瓶(见图3)，容积26ml。电热碱压燕发器(见图1) oAl. 1.3试剂过甲酸取9m1分析纯酸加人lml 30%过氧化氢混合，在室温放2h以上。Al. 2.4测定步骤Al. 2.4.1过甲酸氧化a称取一定量食物样品置于水解瓶中，使样品含蛋白质量在6 10mg，加人lm挝甲酸试剂，在室温放置3h,b加lml乙醉中止氧化。c将样品瓶置于电热减压燕发器中，于4 6 0C减压蒸干，用lml去离子水淋洗瓶壁，再蒸干，反复3次以除
17、去过甲酸。Al.2.4.2Al.2.4.3盐酸水解同上述十六种氮基酸分析中步骤(2)及(4)-(9).上机分析_pBI旦J7210坐一_在Beckman6300氨基酸自动分析仪上，在柱温60时用pH3. 26柠膝酸缓冲液洗脱，半耽磺酸的出峰时间约在1. 78min oAl.2.5计算上机样品液(60p 1)中半脱确砚R(nmol)-上机标准被中半脱砚sm (nmol) X样品峰百jm/半吮砚.标准峰面积100g样品中价红二，吸上机样品中半倪劝.jk(nmol)X (DX MX 100)/(W X SX 10“X R)式中:D:样品的稀释倍数。M:脱氨酸分子量(ng) oW:称样量(g)。E:上
18、机时的进样量(此处为60N 1) ,Al. 3色氨酸的测定一一荧光分光光度法Al. 3.1原理食物蛋白质在酸水解过程中，其色氮酸极易被分解，本法用碱水解蛋白质，直接测定色氨酸的天然荧光。在蛋白质水解液中，只有色氮酸和酪氨酸可以检测到荧光。在PH为11时，色氨酸的荧光强度比酪氨酸大10。倍，且两种氨基酸的荧光峰相差40多nm，利用此特点可在有大量酪氮酸存在下，检测色氨酸的含量。Al. 3.2仪器荧光分光光度计。减压蒸发器(见图1)(无加热部分)。螺丝盖大口瓶瓶盖上有橡皮垫。小玻璃球直径1.8cm,Al. 3.3试剂A1.3.3.1 6N氢氧化钠内含。.6%可溶性淀粉，临用前配制。A1.3.3.2
19、 4mo1尿素溶液(调pH到11) oA1.3.3-3 6N盐酸1份优级纯浓盐酸加1份重燕馏水。Al. 3.3.4澳百里酚蓝0. lg指示剂加0. 1N NaOH溶液1.6m1配成0.06水溶液。Al. 3.3.6高纯氮(含量99.999%)。A1.3.3.6辛醇甲苯溶液含1%辛醇。Al. 3.4测定步骤侧由3/T21O-l4Al.3.4.1称取含粗蛋白质约二的样昌sit于豪四红乙始管中.加含可溶性淀粉的6N NaOHlml,加人1摘辛醉。Al. 3.4.2将10-12支样品管，分别盖上小玻肩球，放于一只带级丝盖大口瓶内.将饭置于喊压燕发装置中，加冰、盐降温.，减压至真空度到1. 3HP如有，
20、则应于分液漏斗中加水洗数次后，加无水硫酸钠或氯化钙使之脱水，然后蒸馏之。A2. 1. 3. 7 20-26%三氯化锑仿溶液溶20- 26g三氯化锑于l OOm 1氯仿中。储于棕色糖浆瓶中，并尽量减少吸收水分的机会。A2. 1.3.8A2.1.3.9醋酸JI。维生素A醋酸醋或维生素A标准油剂。维生素A极易被光破坏，试验应在暗室中进行，或用棕色玻璃仪器。A2. 2测定步骤与结果计算A2. 2. 1制备维生素A标准曲线DB13/T210-94一一一一一一一一一A2.2. 1. 1配制标准液精确称量一定It的标准维生素A，以抓仿在I瓶中溶解。再以抓仿稀释至不同浓度，顺次分别移抓仿lml及各种不同浓度的
21、标准液各lml于相应的比色管中。每管加人醋酸酥一滴。A2.2.1.2、显色及比色先将一个比色管装人loml氛仿，插人比色架的一个孔中。再将盛有lml氯仿(试剂空白)或不同浓度的标准液的比色管先后插人比色计的另一孔中。将盛loml氛仿液管先放置于光道下于620nm波长下调节光密度至0.产即将插在另一孔的管子移人光道，迅速加人，ml三抓化锑氯仿溶液.。于6秒钟内测定光密度，将所得结果于方格纸上划成标准曲线。此曲线应为一直线即浓度与光密度成正比。例:比色管维生素A含量光密度光密度(IU)(减去试剂空白后)7.80.11114.624.30.0200.1310.2410.3830.4660.6600.
22、6730.7900.2210.3630.4360.6400.6630.7702964.98882346.且2nO4工06叮.8A2.26 2样品分析根据样品性质，可分别采取皂化法或研磨法。A2. 2. 2. 1皂化法适用于维生素A含量不高的样品，可减少维生素A以外的脂溶性物质的干扰。但全部试验过程太长，费时间，且易招致维生素A的损失。a皂化:根据样品中维生素A含童不同，称取0. 6- 6g样品于三角瓶中，加人loml60%氢氧化钾及20-r 40m l乙醉，于电热板上回流30m in至皂化完全为止。b提取:0将皂化瓶内棍合物移至分液漏斗内。以30ml水洗皂化瓶，洗液并人分液漏斗。如有渣子，可将
23、皂化的棍合物经过放有少许脱脂棉的润斗撼人分液拐斗内。0用60ml乙酸分两次洗皂化瓶.并人分液拐斗中。一.一一广一一一一一DB13/ T210-94一一一一口摇动分液漏斗，偶尔启塞，以减低瓶内压力。静置等待两层液体分离摇时不要用力过猛，否则易成乳状，难于分离。如遇此种情况，可加乙醇数ml;若仍无效，可再加水数ml即可分开。将水层放入第二个分液漏斗内，醚层仍留在第一个分液漏斗内。再以醚约30m l分两次冲洗皂化瓶，倾人第二个分液漏斗中，振摇之。静置待两层分离后，将水层放人三角瓶中，酿层放人第一个分液漏斗中。重复1-2次或至水液中无维生素A为止.。c洗涤:0将约30m l水加人第一个分液漏斗中，轻轻
24、振摇，静置片刻后，放去下层水液。0将约16- 20ml 0. 6NRNC氢氧化钾液加人液漏斗中，轻轻振摇后，放人下层碱液。经此洗涤后可除去酸溶性酸皂。继续用水洗涤，每次用水约30m l，直至最洗液与酚酞指示剂无颜色反应为止大约三次即可)。在放去最后一次洗涤水后，将酿液静置10 20m in，然后小心放出析出的水分。d蒸发醚液:将醚液经过无水硫酸钠滤入260或300ml三角瓶。再用约26ml醚冲洗分液漏斗及硫酸钠两次，并人三角瓶中。、将三角瓶于水浴上燕馏，收回醚液，待瓶中剩约6m1时取下，用抽气机减压抽干。，立即加人一定量的氯仿使溶液中维生素含量在适宜浓度范围内。e显色及比色:0于一比色管中加人
25、loml氯仿，加人一滴醋酸酥。于一比色管中加入lml氯仿。于其余的比色管中分别加入各lml样品溶液及1滴醋酸配。象制备标准曲线时一样进行比色，记录光密度。例:样品2g皂化提取蒸千后，溶于6ml氯仿，吸llm氯仿液作比色测定，从标准曲线上得知此液每lml含维生素A 23. 41U ,每1 00g样品含维生素A- 23. 4 x 5 x (100/ 2)“68601U侧由3/T210-9sA2. 2. 2. 2研磨法适用于维生素A含A较高的样品，特别适用于肝的分析。此方法步骤简单同省时间，结果准确。但当每9样品中维生素A含t少子6-10P g时不宜用此法。因在此情况下显色时受维生素A以外的脂溶性物
26、质的干扰，加人三氯化锑时发生混浊。a研磨精确称2- 6g样品放人事先已有3-5倍样品重的无水硫酸钠的乳钵中研磨之，至样品中水分完全被吸收，两者很匀为止。不要用太多硫酸钠，否则会在以后用乙酸提取时形成大量很细的棍悬物，不好分离。如果样品在冰冻状恋下就开始研磨，需用的硫酸钠要少些，磨干得也快些。b提取小心将全部磨干的样品棍合物移人带盖的三角瓶内。准确加人60-rl OOm 1乙酸。紧压盖子，用力摇2m in，使样品维生素A溶于乙酸中。然后将瓶子放置一边，待其自行橙清(大约需1-2h)，或用离心机来分开固体物。因乙醚易挥发，在夏天这几步最好都在冷水浴中进行。装乙酸的试剂瓶也应事先放人冷水浴中。c燕发
27、取乙醚液2-,- 6ml，放人比色管中，在?0-80水浴上抽气燕干。立即加入抓仿lml溶解残渣。首创此法的作者指出，应在通甄气的情况下燕干(我们试验的结果不通氮也可以，维生素A回收率在98%以上)。d显色及比色同皂化法中显色及比色部分。例:取肝样品2g与硫酸钠研磨后以l OOm 1乙吐提取。取2ml乙醚液燕干后，溶于lml抓仿中，比色，从标准曲线上查出lml抓仿溶液中含有l OIII o1008样品中维生素A含量一10 x (100/ 2) x (100/ 2) = 26000W注:0乙趁中是否有过载化氮的检脸法侧6ml乙吐入试苍中，加入灼1m160%HL，摇报0.6-lmine如来乙眺中含童
28、有多7t过软化氮刻可将BL中的曦孰化，放出游离峨，水层呈黄色。扣无明A的黄色，别可加入1滴1%旋粉瘩液，有过载化氮则水层出则!色.2H L+H,O,L,+2g O H口酒精中是否含睡的检脸法先配制孰化橄氛液备用(加浓氛液于6% AgNO,中，直至氧化银的沉沈重溶解为止.加入10% NaOH毅滴，如发生沉沈，再加入浓氛液使之洛解)。一一一一一一一一一一一一一一一一DB13/ T210-94一一一.一于试管中盛2m1上迷氧化银氛液，加入几滴英馏出的酒精摇匀，加入少许10%NaOH液加热。如酒精中已无醛，则没有银沉淀，否则有银镜发生。RCHO+2AgOH+NH,OHRCOONH,+2Ag杏+2 H,
29、O氛仿分解物的检验法氛仿不德定，放I后易受空气中氧的作用生成氛化氮及光气。2CHCL,+O:一2HCL+2CCL,0检查时可少取少量氛仿笠试管中，加水少许摇振之，使HCL溶到水层，加入几滴AgNO,液，如有白色沉淀即说明氛仿中有分解产物。装过三氛仿锑的瓶子或管子应先用盐酸洗，然后再用水洗。如此时仍有白色沉淀产生，仍须再用盐酸洗，因三孰化锑易水解，生成不容解于水的白色沉淀:SbCL,+2H,0SbOCL杏+H,0+2HCL样品中维生素A已否提净的检脸法取最后一次的醚提取液2m1孟于试管中，加入少许三氛化锑。如无蓝色反应，说明维生素A已经提净。样品中含维生素A 11000IU时用40m l乙醚提取
30、6-6次即可提净，样品含量低者提取3-4次即可。有人指出，蒸发及抽干时应通入二氧化破或氮气，以防止维生素A氧化玻坏。抽干的时候应尽速加入熟仿，因维生素A在干燥状态下极易被氧化破坏。使用一般分光比色计时，调节未知溶液使其透光度在30.70%之间，可得较准确的结果。A3.胡萝卜素测定法(柱层离分析法)A3.1原理、仪器及试剂A3.1.1原理胡萝卜素常和叶绿素、叶黄素等共存于植物中。这些色素都能被有机溶剂提取，所以测定时一定要将胡萝卜素与其它色素分开。以前常采用液层分离法，利用双丙酮醇或甲醇，将其中的叶黄素等与胡萝卜素分开。此法的缺点是不能完全除去不具生理价值的类胡萝卜素，因此所得结果不能代表真正的
31、胡萝卜素含量。目前为大家广泛采用的柱层离分析法，利用一定的吸附剂对不同色素的不同吸着能力，将样品提取液中有生理价值的胡萝卜素从类胡罗卜素中分出来。在适当条件下，各种色素被吸在吸附柱的不同位置上，形成色层谱。然后用洗脱剂将所需要的胡萝卜素洗下，在吸收光最多的波(长下测定其浓渡，从而推算样品中所含胡萝卜素含量。A3.1.2仪器一一行DB13/ TA0-94一一一一一砂一一一下列仪器设备可够一个人同时作8个侧定之用。名称规格数量厚壁杯容量约l OOm 1,底及壁要厚;8底部内面半回形.磨成糙面，另附研锤玻璃漏斗6 6cm 8抽气管16 x 2. 6cm，上侧有抽气支管8分液漏斗300- 600m1
32、10水浴锅1离心管或试管15X 160mm 8层析管上端漏斗形部分容积约60m 1;中部长约1 Scm，内径0.8-1 cm,下部长约7- 8cm，内径。.6-0.6cmo塞棒可用一个木质或金属小板或软木塞上装长柄。小板或软木塞直径1应比层析管中部内径小0.1-0.2cm，使之能在其中上下自由移动，以压平吸附剂。锥形瓶126m1 8光电比色计1(或分光比色计)量筒26, 100m1各1抽气机1普通燕锅1胡萝卜素因易为紫外线所破坏，所以玻璃器具最好用棕黄色的。AS. 1.3试剂A3. 1.3.1丙酮。AS. 1. S. 2石油酸为侧定新鲜蕊莱果品用的石油酸，沸点应为40“- 70C;为侧定干菜干
33、果等用的石油醚，沸点应为80- 100 C。此石油酸应不含水分及杂质。沸点限度及纯度均不够标准的市售品，应重行燕馏后再用。一一一一一一一一一一一一一一DBl80 100石油醚可燕抽工业用汽油，收集80-100部分备用。AS. 1.3.3活塞滑润剂22g甘油加9可溶性淀粉，加热至140后放it 1.6h，倒出上层，静置隔夜即可用。A3.1.3.4玻璃粉将碎玻璃于铁磨中磨细.用20目网眼的筛子筛过后，先用浓盐酸浸泡，使铁溶去，然后再以淡氢氧化按浸泡，最后用清水洗净至中性后在烘箱中烤干。A3.1.3.6无水硫酸钠为脱水之用，不应有吸着胡萝卜素的能力，所以每用一批新的无水硫酸钠，都应将它和少量胡萝卜素
34、溶液在一起摇振，然后看留在溶液中的胡萝卜素有多少，如损失过多则不能用。A3.1.3.6滤纸用不吸着胡萝卜素的滤纸;不吸着胡萝卜素的棉花也可用。A3.1.3.7吸附剂吸附剂的种类很多，一般采用纯氧化镁0。用前将氧化镁通过80-100目网眼筛子筛过，然后置烤箱(800- 900.0)中烤3h备用。A3.1.3.8氢氧化钾60g氢氧化钾溶于60m l水中。A3.1.3.9脱醛乙醉制备方法见维生素A侧定法。A3.1. 3. 10乙醚须无过氧化物存在方可应用，其处理方法见维生素A侧定。A3.1. 3. 11酚酞溶液lg酚酞溶于少盆乙醉，然后稀释至100m 1,A3. 1. 3.12洗脱剂3%丙酮的石油酸
35、浴液。一般用3m1丙酮加人97m拓油醚(80-100部分)中作洗脱剂，加人丙阴之I可随悄况在2-10%间改变。丙酮越多，洗脱力越大;但必须注意只使胡萝卜素冲洗下来，而不使其他色素随着冲下来口。A3.1.3.13胡萝卜素标准液溶20m g晶体标准胡萝卜素印于3-6m1抓仿中，然后以石油酸稀释至50m l。由此再稀释至作标准曲线所需要的各种浓度。此标准液于临用时配制，因为它在2-3天内就会破坏。A3. 2侧定步骤与结果计算A3. 2. 1侧定步骤胡萝卜素易为阳光破坏，所以在实验进行中应邀免阳光直接照射，在较暗的实验室即可。AS. 2. 1. 1提取a从新鲜蕊莱及水果中提取胡萝素，主要用Booth氏
36、法，略加改进。0将新鲜样品以燕汽处理02- 6min后(燕前及燕后都要称重)!打碎机中打碎_一.-一DB13JT210-94一一一一一一一一一一一一一一一一(如样品过干不易打碎，则可加人已知重量的水分。但加人的水分应尽可能的少)或切碎。称1-2g样品(估计其中应含有60-100 g胡萝卜素)，放人厚壁杯中，立即加人1- 2 g玻璃粉及6-8ml 1:1的石油醚丙酮溶液，以玻璃锤研磨之。静置片刻，将上部澄清液倒入一盛有约l OOm 1水的分液漏斗中。将剩下的残渣用力研碎，然后加人6-r 8ml石油醚丙酮(1:1)混合液，再磨待澄清后，倒入前一分液漏斗中。因重复前一步操作，如样品多时，可在提取一两
37、次后用纯丙酮提取一次，然后再继续用混合液提取，直至没有胡萝卜素提出为止。摇动分液漏斗lmin后静置之，使水与石油酸分开，然后放水液层人另-600ml分液漏斗中。以水洗3-4次，将水液层集中在另一液漏斗中。0向盛水液的分液漏斗中，加入6ml石油酸，摇动，放去水液层，将石油醚液加人样品漏斗中曲。向合并的石油醚样品溶液中，加少许无水硫酸钠，摇振后装人层离管进行分离。b从干制植物性样品中提取胡萝卜素，主要用Quac-Kenbush氏法0将干样品磨碎，用40目网眼筛子过筛。称干样品。.6-4g(一般用1g)，放人一锥形瓶内，加入20ml 3: 7丙酮和石油醚(8。一100部分)混合液，在电热板上回流1h
38、。回流速度应调节至每min从冷凝管滴下石油醚1-3滴，或加上塞子放置室温暗处过夜(至少16h)0将锥形瓶内混合提取液倒人一盛有约l00ml水的分液漏斗中。将残渣连续提洗数次，每次用约6-,- 8ml石油醚，提洗液并人前一分液漏斗中，洗至提取液无色为止。(5)(6)(7)(8)四步同新鲜蔬菜及水果。动物性食物及其它含脂肪的食物，称样品1-4g(约含胡萝卜素60- 100ji g),皂化，提取步骤完全与维生素A测定中的皂化与提取相同，唯最后乙醚液经减压蒸干后，加人20m l石油醚溶解之。准备装人层离管。A3.2.1.2层离a层离管制备。装少许玻璃棉或脱指棉于层离管尖部，压紧后，装入氧化镁约1 Oc
39、m高晒，装时以手轻击管柱，可使其更加均匀。将层离管接在抽气管上抽气。以有柄小塞棒轻压。如仍需加人吸附剂，则应先将表面用骨匙或铁丝弄松后再加，以免前后加的氧化镁不能很好地相连。管一一一一一一D81塑810-94一一一一一一一一一一一内的氧化镁装至约高8cm后，将表面压平(见图4).图4层离装置加人约lem高的无水硫酸钠(12)加10- 20m 1石油醚于层离管内.使吸附剂湿透并赶走其中的空气。抽气管内可放一试管或离心管以接纳上面流下的液体。b分层及洗脱。0当硫酸钠上面还有少许石油醛时，即将提取液自分液拐斗中倒人层离管。立即抽气。0用6- 10m1洗脱剂洗分液漏斗，待提取液已几乎全部进人硫酸钠时.
40、加人层离管(13).0连续用洗脱剂洗层离管至胡萝卜素随溶剂洗下，溶液出现黄色。将此黄色液接于试管或离心管中.管子满后可倒人量瓶均。继续冲洗至找液由黄色变无色为止。口集中全部黄色液体在一量瓶内。用石油酸稀释至刻度，浓度最好在每.1含1tug-A.3.2.1.3、浓度侧定a未知液浓度洲定。0在分光比色计光波长440n.处侧定溶液硕色的强度，以石油酸作空白。溶液颜色愈深，表示所含胡萝卜素越多。0以比色所得读数在标准曲线上查出每iml所含胡萝卜素的量，然后根据取样_DB131 T210-94_悄况计算每100样品所含胡萝卜素童(iq0b标准曲线或标准曲线表的制备0精确称取晶休纯日胡萝卜素或90%p及1
41、0% a胡萝卜素20m g，溶于少量抓仿中，然后以石油酸稀释至60m1,0用上述标准液配制不同浓度的标准液(0.2, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0,2.4 ug/ ml)，于分光比色计上440nm波长处侧定其光密度。口以标准液的不同浓度及比色所得光密度读数在方格纸上画成曲线。此曲线应为一直线，即浓度与光密度成正比。A3.2. 2计算例:.新鲜菠菜100g,经过燕汽处理后重，8g，打碎后称取2g，用上法侧定胡萝卜素含量。最后收集滤液并稀释至60ml，在比色计中侧其光密度为0.42。样品中胡萝卜素含量可先查标准曲线表得出每ml溶液含1. 723ug,则应计算为:1.723x 50
42、x ( 100( (2x 100)x98(燕后重f)/100(荟菌重2)二4. 221mg/ 100g注:(1)由此法所侧得者系总胡萝卜素含童，即。一胡萝卜素+R一胡萝卜素+丫一胡萝卜素。但a一胡萝卜素及丫一胡萝卜素的生理价位均只及R一胡萝卜素的一半。不过一般筑莱中a一胡萝卜素，加为黄色，则仍须维续提取;加在两三次提取后样品完全脱水了，可加入3-4A水一起研磨。这不仅可带助提取色素，而且使残渣泉集，容易将提取液例出。水洗的目的爱洗净丙酮，以免层析时，减低了吸附荆对色素的吸附力。(8)有的文伙说要洗3次，但我们的经脸1次即可。(9)有的文蔽说干样品应先用少全水池6 - 10m in,然后再加提取
43、荆。我们的经脸是加水后会使样品粘在一起，使提取更加困难，不易提净。帅一般跳莱浏定时，不需加入太多载化候，压梦后只要有8cm高即够。洲定名化样品中胡萝卜素，氧化模柱可稍加高(l Ocm) e仙抽氛机应一直开动着，以便使吸附荆压得较均匀一些。如欲使色素分离较快，或者使色层看并更清楚，可用1:1的氧化铁与super-eel的混合物作吸附荆。super-cel爱一种劝滤荆，可增加过涟速度。叼加入无水硫酸钠，为的足防止上部吸附鹅在层离过程中被扰动，同时可吸收提取液中徽t的水分。叼aAE过层离管下来的首先是无色液体，因色素已被吸看。将此无色液例入一瓶中待落偏后再用;或用作冲洗液。b当第一次用冲洗荆洗分液资
44、斗时，应少用一点，使色素能吸在较摄的段吸附剂上而有较长一段吸附荆留作分层用。c吸附柱上色素排列的次序加下(由上到下):叶绿素、叶黄素、德黄素、番茄红素. Y一胡萝卜素、日一胡萝卜素、a -胡萝卜素。树a在冲洗过程中应使硫酸钠一直有洗脱剂浸着，不可抽干，否则会有空气被吸入而使胡萝卜素玻坏。b层离管的冲洗速度与色层的清造程度，根据洗脱荆中丙酮的百分比来决定。丙酮的比例可在0-10%间变动，丙阴多些可使冲洗较快。若提取液中有多童无生理作用的色素，和叶黄素、番茄红素及其它固醉等杂质，别应使用丙阴较少或不加丙酮的冲洗液，使它慢慢分开。c如若胡萝卜素与非胡萝卜素同时被冲洗下来，到可将此液体浓编后再如前法例
45、入一断的层离苦内层离之。的加热时日一胡萝卜素极易异构化，而生出断的日一胡萝卜素。断日一胡萝卜素同时录存在于自然食物中.因此要侧得较准确的胡萝卜素含I，可在436nm处比DB13/ T210-94色。因为在此波长处两种色素的吸光能力相等，所以一般选择440nm。有的人用460nm，其盖误在10%以内。A4配合饲料维生素D测定法(SbCL.比色法)A4. 1原理、仪器、试制及层析柱、样品的制备A4.1.1原理维生素D测定法有生物学法、气相色谱法、高效液相色谱法及三氯比锑比色法。对于维生素D含量较高的样品，例如:鱼肝油或强化食品，三氯化锑比色法仍是一种可行的方法。维生素D与三氯化锑乙酞氯二氯乙烷溶液
46、作用后呈淡粉红色，其颜色的深度与Vo量成比例关系，在比色以前用毛地黄皂贰沉淀胆固醇，用吸附剂除去干扰杂质，并用马来酥沉淀速留醇，然后在600nm和660nm处比色测定。A4.1.2仪器名称数量721型分光光度计1旋转浓缩仪1真空泵1高纯氮气1恒温水浴1振荡器1260m1圆底皂化瓶12600m1具塞三角瓶4层析主2. Ocm内径X 30. Ocm长柱体，柱体上123. Oc。内径X 10. Ocm长圆柱泡。圆柱泡上的磨口可接260m1分液漏斗，柱下端具塞A4.1.3试剂A4.1.3.1石油醚(AR30-,-60重燕)。A4.1.3.2无水乙醚(AR重蒸)。A4.1.3.3异辛烷(AR重燕)。A4
47、.1. 3. 4甲苯(AR重燕)侧血封T210-男A4.1.3.6苯(AR重燕)。A4.1.3.6乙跳抓(AR重燕)。A4.1.3.7醋酸醉(AR)。A4.1.S.8无水乙醉(AR).A4.1.S.9碑酸氢二钠(AR Na,HPO, “ 12H,0) .A4.1. 3. 10丙三醉(AR).A4. 1。3.11氢镇化钠(AR)。A4.1.3.12氢氧化钾(AR).A4.1.3.13 BHT(2, 6一二叔T基对甲醋AR).A4.1.3.14 VD,(Vitamin D, USP)。A4. 1. 3. 16毛地黄皂贰A4.1.3.16聚乙二醉600.A4.1. 3.17中性氧化铝(80-10。目
48、色谱纯)。A4. 1. 3. 18酸性101白色担体(Chromosorb W色讼纯)。A4. 1. S. 19漂白土(fullers earth色谱纯)。A4.1.3.20二抓乙烷(AR)用60g KOH和约Ocm哟侣箱回旅IL=抓乙烷，h,移走HOH和铝箱，将溶液和6gp,O者未一起摇动.燕.收集.弃去前50m l收集溶液。A4.1.3.21染色抑翻溶液异辛烷、甲苯、.巨醉1:1:1V矛V.A 4.1. S. 22抗坏血酸钠涪娜3. 6g抗坏血曲于20m1 INN&OH溶液中。当日配翻。A4. 1. S. 28硫化钠洛液溶解12gNa刀“ 9H,0于，Oml水中.用87%的丙三醉稀释至10
49、0=1.A4.1.5.24焦性没食子橄铸液称取20g焦性没i子酸于少许无水乙.中.称释至l OOm l.A4.1.3.26马来醉溶液A.-贮任液:取I Og马来醉溶于少许苯中招释至100ml，存冰箱中。B.工作液:取1.0m1贮奋液用甲苯稀释至loml以获得1%洛液。A4.1.5.26染色剂a贮备A液称取110三抓化锑(AR或CP)溶于400= 1=抓乙烷中。加人粗无水A L,O,M合，通过挂纸过泣于600=1容f瓶中。用二抓乙烷招释至刻度。取一定I配制好的A液到2cm比色瓶中，以二抓乙烷为空白.在600n二处翻定.吸收的光密度应小于0,070.一一一一一一一-一一一一一一DB13b贮备液B液在通风柜中将l OOm 1无色重燕抽的乙跳抓与400m 1Z抓乙烷混合，贮存在冰箱中。工作液取90ml A液与loml B液混合，贮存在有盖
