1、:Si地DB13方标准卜.月月河省DB13/T498-2004商品肉鸡大肠杆菌病防治技术规程2004-03-10发布2004-03-10实施河d匕省质量技术监督局发布DB13/499-2004前言本标准附录A,附录B为规范性附录。本标准由河北省畜牧局提出。本标准起草单位:河北省畜牧兽医研究所.本标准主要起草人:张继东、李椒芳、杨国恩、王玉清、杨淑亚、薛宗丽.DH 13/499-2004商品肉鸡大肠杆菌病防治技术规程1范围本标准规定了商品肉鸡大肠杆菌病的诊断和防治.本标准适用于肉鸡饲养场和动物诊疗单位对肉鸡大肠杆菌病的防治。2规范性引用文件下列文件通过本规范的引用而成为本规范的条款。凡是注日期的
2、引用文件.其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据木标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版木.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.NY5035无公害食品肉鸡饲养兽药使用准则NY503fi无公害食品肉鸡饲养兽医防疫准则NY/T5038无公害食品肉鸡饲养管理准则中华人民共和国动物防疫法(第八届全国人大常委会1997年7月3日颁布)中华人民共和国兽药典(2000版)3术语和定义下列术语和定义适用于本标准.商品肉鸡大肠杆菌病山致病性大肠杆菌引起的商品肉鸡的原发性或继发性的细菌性传染病.该疾病主要危害肉雏鸡.其特征表现为败血型、脐炎型、肠炎型、
3、气囊炎型、关节炎型、眼炎型、肉芽肿型和脑炎型等多种病型.是目前危害商品肉鸡业的一种重要的细菌性疾病之一4诊断4.1诊断原则通过流行病学调查、临床表现、病理变化等作出的临床诊断可作为处理疫情的依据.经病原分离鉴定。排除其他病原感染.则可诊断为原发性大肠杆菌病。继发性大肠杆菌病的诊断，必须在其他原发性疾病荃础上分离出大肠杆菌.4. 2流行特点4. 2. 1发病日龄各年龄商.钻肉鸡均易感.2045日龄的商品肉鸡发病流行最普遍。脐炎型发病较早.出生后即可能发生。其他病型4- 10日龄即可能发生，通常30日龄前后的肉仔鸡发病较多.4. 2. 2发病率和病死率发病率和病死率与大肠杆菌血清型及菌株的毒力、有
4、无继发和并发感染、饲养管理水平、环境卫生条件、防治措施是否及时有效而差异较大。一般发病率为11%-6996,病死率3. 89672. 9%,4.2.3发病季节大肠杆菌病一年四季均可发生.但以冬末春初较为多见.4. 2. 4传染途径4. 2. 4. 1消化道饲料及饮水被大肠杆菌污染，肉仔鸡采食或饮用后通过消化道而感染.DH13/499-20044.2.4.2呼吸遁带有大肠杆一的尘埃被吸入，进入呼吸道后侵入血液引起感染。4.2.4.3蛋壳穿透蛋壳表面污染的大肠杆菌很容易穿透蛋壳进入蛋内。这种种蛋常于孵化后期引起死胚，或刚孵出的小鸡即可发病。4. 2. 4. 4垂直传播患有大肠杆菌性输卵管炎的母鸡，
5、在蛋的形成过程中大肠杆菌即可进入蛋内，造成垂直传播。4.a临床症状致病性大肠杆菌所致疾病的临床表现与鸡只的发病日龄、病程长短、受侵害组织器官与部位、有无继发或并发感染有很大关系.根据商品肉鸡发病的临床表现主要分为以下类型:a)败血型:表现为离群呆立或挤堆，羽毛松乱。食欲减退或废绝。排黄白色稀粪.打喷嚏，呼吸困难，咳嗽.头部皮.卜水肿等症状，多在发病2d-4d内死亡。部分病鸡不表现任何临床症状或症状不明显而突然死亡。b)脐炎型:主要发生于孵化后期的胚胎及出壳后的雏鸡。病死率为396-10%，有时高达4096,主要表现为卵黄吸收及脐带收缩不良，脐带发炎、湿润、发红、肿胀，脐孔闭合不良或不闭合.周围
6、皮肤星紫褐色，采食最减少或不食，精神沉郁，下痢.患有该型大肠杆菌病的肉鸡多在出壳后2d-3d内死亡。不死的病鸡生长也较缓慢。c)肠炎型:主要表现腹泻，粪便呈黄绿色水样，消瘦，脱水，最后衰竭死亡。d)气囊炎型:多由败血型转变而来，发生气囊炎与肺炎，3周龄以上肉仔鸡多发.表现为精神沉郁，呼吸困难，咳嗽，有湿性罗音，食欲减退或废绝，伴有腹泻、腹腔积液.后腹部软而大。e)眼炎型:表现为眼睑肿胀，流泪.结膜潮红，角膜浑浊，有脓性分泌物，瞳孔缩小，眼球萎缩、凹陷.失明(多数为单侧失明).f)关节炎型:多由败血型或肠炎型等转变而来.表现为关节肿大，跋行.e)脑炎型:发病鸡以嗜睡为主要特征。h)肉芽肿型:病鸡
7、排黄自色稀便，生民发育受阻.4. 4病理剖检变化4. 4. 1败血型纤维素性心包炎，心包肥厚、浑蚀，呈乳白色，甚至有多量纤维素性渗出物.或与心肌粘连.常伴发肝脏肿大，肝周围纤维素性渗出。甚至整个肝脏被一层纤维素性薄膜所包裹.腹腔内有数量不等的腹水，棍有纤维素性渗出物。或纤维素性渗出物充斥于腹腔器官，造成腹腔各器官的纤维素性粘连。有时伴发气囊炎，气囊增厚、浑浊。4. 4. 2脐炎型卵黄吸收不良.卵黄膜菲薄.卵黄液化.呈黄褐色或黄绿色水样。混有干酪样颗粒物，恶矣。常伴有腹膜炎和心包炎.脐部肿大。皮下水肿，脐孔闭合不全。4.4.3肠炎型小肠钻膜充血、出血、溃疡，肠内有大量液体，直肠内有多量绿色稀粪.
8、腺胃默膜充血或出血。胆襄肿大。充满胆汁。4. 4. 4气班炎型胸腹部气囊高度浑浊.增厚.有时早黄褐色.囊腔内有数量不等的干酪样物。胸腹腔均有大量混浊渗出物。肺部发炎、充血、出血、坏死，气管内有大量戮液，气管戮膜充血、增厚、鼻腔有大量戮液。4. 4. 5关节炎型DH 13/499-2004病变关节(以跄关节多见)肿胀，滑液增多、棍浊，关节班内有干酪样物，有时出现关节粘连.4. 4. 6肉芽肿型在肝、盲肠、十二指肠和肠系膜形成肉芽肿.4. 5病原学诊断4. 5. 1病料的采集当鸡群发病后，最好将典型病例活体或整个尸体送检。尸体送检应在病鸡死亡后，立即送检。送检病料应取自未经抗菌药物治疗的病鸡。急性
9、死亡病例，其肝、脾、心血、卵黄囊和脑等均可作为特检病料.4. 5. 2病原检验程序病原检验程序应按图1所示进行。待检病料直接涂片鉴别培养增菌培养革兰氏染色，葬球.之康豁伊红跳挂平板镜检可疑菌落纯培养鉴定动物试验血清学试验，落.征、汾片革兰氏处色位挂。生化试脸图7大肠杆菌分离培养与鉴定程序框图4. 5.3病原分离培养无菌操作，在待检病料表面切一小口，用灭菌铂金耳从中雨取组织或血液，接种到鉴别琼脂平板培养基上或增菌肉汤中.37C培养24h0用抗菌药物治疗过的病鸡，在初步分离细菌时.应先进行增菌培养，然后进行鉴别培养。送检尸体剖开后应先进行接种培养，然后观察各内脏器官的病理变化.4. 5. 4病原体
10、形态学观察4. 5. 4. 1菌落特征大肠杆菌在营养琼脂平板培养基上形成的菌落边缘整齐、表面光滑、湿润、低而微隆凸、中等大小、无色半透明、露珠样菌落;在麦康凯琼脂培养基上菌落呈粉红色:在伊红一美兰琼脂平板上菌落呈紫红色、隆起、表面湿润、带有蓝绿色的金属光泽。4.5.4.2细菌形态将病料及培养物涂片或抹片.经革兰氏染色后镜检.革兰氏染色时，大肠杆菌为革兰氏阴性、无芽胞的短小杆菌.多单在或成双而不形成长链，多数有鞭毛，能运动.4.5.5生化试验鉴定在进行肠杆菌科的属、种鉴定时，生化特性是重耍的指标，但生化试验不能鉴别菌株有无致病性.DB 13/499-2004主要的鉴定试验为糖发酵试验。维一拉止氏
11、试验及柠檬酸盐利用试验阴性，靛墓质及甲基红试验阳性.生化试验方法按附录人的规定进行。4. 5. 8致病性试验4. 5. 8. 1显角膜结膜试验用铂金耳钩取菌落涂入豚鼠眼结膜内.如有产肠毒素型大肠杆菌存在，则引起角膜结膜炎.4. 5. 8. 2小鼠接种试验取分离物29h肉汤培养物腹腔接种1822g小鼠。每只小鼠接种0. 2m1，接种后72h死亡，即证明该分离物具有致病力。4. 5. B. 3易感雏鸡接种试验取分离物24h肉汤培养物0. 3m1-0. 5m1腹腔接种2周龄内易感雏鸡，多在1d-7d内死亡.表现与自然病例相同的症状和病理变化。4. 5. 7血清学检测用已知大肠杆菌的单因子血清，对经细
12、菌学确定为致病性大肠杆菌的分离菌株进行鉴定.在禽病中常见致病性大肠杆菌的血消型有儿十种。占优势的血清型有Oi, Os, On, Ois, Oas, ws, Om。不同地区致病性大肠杆菌的血清型差别较大。5防治5. 1养殖环婉卫生5.1.1每批鸡出栏后应对鸡舍、用具进行清洗、消毒，消毒剂的选择应符合中华人民共和国兽药典，的规定.清理完毕到一次进鸡前空舍至少2周.6.1.2应实行全进全出制饲养，同一养殖场不能饲养其他禽类.1.口应及时清除潮湿的垫料和粪便，在固定地点高温堆肥处理.5.1.4应保持育雏舍温度稳定，不能忽高忽低，饲养密度要合理，舍内通风应良好。5. 2饲养方式可采用地面散养或网上平养方
13、式。地面散养时垫料要干燥、无霉变且不应有病原菌群落。有条件的商品肉鸡养殖场应封闭饲养。从肉仔鸡育雏到出栏整个饲养过程中将养殖人员同时封闭在肉鸡养殖允许的空间内。使整个养殖空间与外界环境相对隔离.5. 3饮水曹理应采用自由饮水的方式，确保饮水器不翻水，防止垫料和饲料霉变.饮水器要每日清洗、消毒，消毒剂应符合中华人民共和国兽药典的规定.5. 4眼料管理自由采食或定期饲喂。不应饲喂发霖变质的饲料。上市前7V，饲料中应不含任何药物或药物饲料添加剂.侮次添料量应根据需要确定，保持饲料新鲜，及时清除敞落的饲料.5.5防疫应有效地控制商品肉鸡多发、常见的病毒性疾病.减少慢性呼吸道病的发生.最大限度地减少大肠
14、杆菌病的发生机会。免疫接种应符合中华人民共和国动物防疫法的要求，选择适宜的疫苗、免疫程序和免疫方法.5. 8药物防治5. 6. 1饮水或拌料方式添加兽药应符合NY5035的要求。5. 8. 2抗菌药物的使用应科学规范。对选用药物的剂量和应用时间及休药期应严格掌握.5. 8. 3进行药物的敏感性铡定，以选择高敏药物应用，确保治疗效果。大肠杆菌对抗菌药物的敏感性测定方法按附录B的规定进行.5. 8. 4可使用国家兽药管理部门批准的针对本病的微生态制剂.5. 8. 5可使用国家兽药管理部门批准的针对本病的中草药制剂。:建立井保存治疗记录.包括发病时间及症状，治疗用药的商品名称和有效成分，生产厂家及生
15、产日期，治疗时间、剂址、疗程、疗效及停药时间。记录应在清群后继续保存2年。DH 13/499-2004附录(规范性附录)大肠杆，生化试验方法A. 1糖发酵试验A.1.1试验原理大肠杆菌能分解多种搪、醇，使其产酸或产酸产气，并在与肠杆菌科的其他属、种及其他细菌的鉴别上具有一定的意义，是进行大肠杆菌鉴定的常用试验。A.1.2培养基蛋自陈lOg，牛肉浸膏3g,抓化钠5g, 1. 6%澳甲酚紫酒精溶液0. lml作指示剂，蒸馏水1000m1,调至pH7. 4-7. 6.分装于事先装有小倒管的小试管内，于121高压灭菌15min,供发酵试验常用的糖有葡萄塘、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等.各种糖的加量一般
16、为0. 596-1%，但以1%为好.除萄萄糖、甘露醇在培养基高压灭菌前加入外，乳糖、蔗糖和麦芽搪则需先配制成10%20%水溶液，过滤除菌或115加热15min灭菌后，以无菌操作加入培养基中。A.1.3试验方法以无菌操作.用接种环取少量供试大肠杆菌纯培养物接种于糖发酵培养基中，37恒温培养，每天观察并记录结果，根据需要可培养观察lodeA.1.4结果判定若分解糖、醉后产酸、产气.则培养液变为黄色且有气泡形成:仅产酸则培养液变为黄色，无气泡形成;不产酸不产气者则培养液不变色且无气泡形成。大肠杆菌能迅速分解葡萄搪和甘露醇，产酸或产气.大多数菌株在29h内能分解乳糖、麦芽搪，半数菌株能发酵蔗搪。也可采
17、用半固体琼脂培养基，即在上述培养基内按0. 4%-0. 696加入琼脂，省去小倒管，做穿刺接种。若分解糖、醇类产酸产气，则培养基变为黄色且沿穿刺线或管壁及管底处有微小气泡形成.A. 2甲基红(MR)试验A. 2. 1试验原理细菌在葡萄搪代谢中生成丙酮酸，丙酮酸再被分解生成甲酸、乙酸、乳酸，玻拍酸等。使pH降至4. 5或更低，甲基红指示剂呈现红色。A. 2. 2培养基磷酸氢二钾(K,HPO,) Sg,蛋白陈5g,葡萄搪5g.蒸馏水1000m1。各成分落解后调至pH7. 2.过滤.分装试管.121 0C高压灭菌15min备用.A. 2. 3指示剂甲荃红0. 1g. 95%酒精300m1.蒸馏水20
18、0m1。先将甲基红用酒精溶解后.再加入蒸馏水至500m1,A. 2. 4试验方法与结果判定在培养基中接种少量大肠杆菌培养物，于37培养2d-5d,然后于每5m1培养物中加入甲荃红指示剂5滴-6滴，立即观察结果，呈鲜红色的判为阳性反应.弱阳性的为橘红色.阴性的为黄色.若48h培养物为阴性的(可取部分培养液试验)，则应继续培养4d-5d重试。A. 3维一培(V-P)二氏试验A. 3. 1试验原理有些细菌可分解葡萄糖产生丙酮酸，再将丙酮酸脱筱形成乙酞甲基甲醇。乙酸甲基甲醇在碱性环DH 13/499-2004境中可被氧化为二乙酞进而与培养基内蛋白陈中的精氮酸所含的肌基发生反应，生成红色化合物.即为V-
19、P试验阳性。A. 3. 2培养基应符合A.2.2的要求。A.3.3试剂A. 3. 3. 1奥梅拉(0-Meare)氏法试剂肌酸0. 3g,氢氧化钾(HON) 4Ug蒸馏水100m1。将K011溶于燕馏水中后加入肌酸.A. 3. 3. 2贝克脱(Barrit)氏法试剂甲液为6% a一蔡酚酒精溶液;乙液为40 KOH水溶液。A. 3. 4试验方法与结果判定A. 3. 4. 1奥梅拉氏法取少量营养琼脂幼龄培养物接种，370C培养48h，在每lml培养物中加入相应试剂lml，充分混匀后置于室温或37下4h观察结果，呈现红色者为阳性。.3. 4. 2贝克脱氏法按A. 3. 4. 1的方法接种并培养4d后
20、.在傅2. 5m1培养物中加入相应试剂甲液0. 6m1，再加乙液0. 2m1，充分混匀，阳性反应即刻或在5min内呈现红色。若无红色出现，可静置于室温或37下2h内观察结果。仍不呈现红色者判为阴性。大肠杆菌的维一培(V-P)二氏试验阴性。A. 4靛基质(uil噪。indole)试验A. 4. 1试验原理细菌分解蛋白陈中的色氨酸，生成丙酮酸、靛基质(叫噪)、氨等.靛荃质与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用.生成可见的红色玫瑰靛基质。A. 4. 2培养基蛋白脉(或胰蛋白陈)20g.氯化钠5g.蒸馏水1000m1,溶解后调至p117. 9。分装小试管.121高压灭菌15min备用。本培养基中所用蛋白陈应
21、含丰富的色氨酸.每批蛋白陈应先用已知阳性菌株检验合格后才可供使用.A.4.3试剂A. 4. 3. 1欧一波(Ehrlich-Bohme)二氏试剂对二甲氨基苯甲醛1g. 95%酒精95m1,纯浓盐酸20m1,A.4.3.2柯凡克(Kovac)氏试剂对二甲氨基苯甲醛5g，纯戊醇75m1，纯浓盐酸25m1o配制方法均是先将对二甲氨基苯甲醛溶于醉中，然后缓慢加入浓盐酸，棍匀后置于冰箱贮存.A.4.4试验方法与结果判定取纯培养物少量接种后置于37C培养24h-48h(必要时可培养4d-5d)后.矫2m1培养物中加入上述试剂中的任何一种试剂2滴-3滴，轻摇试管.呈红色者为阳性.或先加少量已醚或二甲苯，摇动
22、试管以提取和浓缩pal噪，待其浮于培养液表面后，再沿管壁徐徐加入上述试剂中的任何一种试剂数滴，在接触面呈红色者即为阳性反应.大肠杆菌的叫噪试验为阳性。A. 5柠椒酸盐利用试验A. 5. 1试验原理某些细菌.r利用培养基中的柠檬酸盐作为碳源，分解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基pH由酸性变为碱性。大肠杆菌不能利川柠檬酸盐，在培养荃中不能生长。A. 5. 2培养基DH 13/499-2004氯化钠5g.硫酸镁(Mg50,7Hs0) 0.2g.磷酸二氢钱1g.磷酸二氢钾1g，柠橡酸钠28.琼脂15g, 0. 2%澳察香草酚蓝40m1燕馏水1000m10将各成分(指示剂除外)加热溶解后调至pH6. 8,然
23、后加入澳康香草酚蓝指示剂.混匀后分装试管，121C高压灭菌15min，制成斜面备用.A. 5. 3试验方法及结果判定将培养物接种于柠橡酸盐斜面，37培养4d-7d.每天观察结果。阳性者在斜面上有菌落生长，培养基由绿色变为蓝色.大肠杆菌柠棣酸盐利用试验阴性。DB 13/499-2004附录日(规范性附录)大肠杆菌对抗菌药物的敬感性测定方法B. 1纸片扩散法B.1.1含药纸片的准备根据需要购买用于大肠杆菌药敏试验的含药纸片。B.1.2培养基的制备用灭菌的普通肉汤琼脂或血液琼脂培养基制成平板，各用。8.1.3菌液的准备从保存和新分离的大肠杆菌培养斜面上钩取少许菌苔.接种普通肉汤培养基。于37C培养1
24、6h-18h，取出作为原菌液。再用普通肉汤培养基或1%无菌蛋白脉水把原菌液作1:1000倍稀释后备用。B.1.4操作步骤B.1.4.1涂菌用灭菌棉棒筋取试菌液均匀涂布于培养墓表面。8.1.4.2放置纸片将各种抗菌药物纸片放置于培养基表而，使其紧贴于培养基上。置37C恒温培养箱内培养16h-24h,B.1.4.3测抑菌圈直径取山培养皿，测量各纸片周围的抑菌圈直径，精确到0. lmmeB.1.5结果判定根据抑菌圈大小判定药物的敏感程度，分为高度敏感、中度敏感、轻度敏感、耐药.B.1.B注意事项琼脂扩散纸片法试验的准确性，随条件的不同而有所差异.如培养基成分、pH值、接种量及操作技术等，都会影响结果
25、的准确性.纸片在平板上放置要等距离.而且不能靠的太近.本法只适用于定性试验.B. 2稀释法8. 2. 1药液的准备用无菌水将供试药物稀释至所需浓度。B. 2. 2培养夔准备普通肉汤培养垂，分装成13支试管.其中第一支装1. 8mL，其余12支装1. OmLe8.2.3试菌液的准备应符合日.1.3的要求。8. 2. 4操作步骤在装有1. 8mL培养基的试管中.加入0. 2mL供试药液。混匀后吸取1. OmL加入装有1. OmL培养基的试管中，并按此方法依次稀释至第12支试管弃去1. Oml.，使药物成为递减浓度梯度。最后一支不加药液作对照。然后加入1. Oml试菌液。并将各试管摇匀，置T a恒温培养l6h-24h观察结果。B. 2. 5最低抑菌浓度的确定经培养后的试管呈澄清状态，摇匀后不出现浑浊。判定为无菌生长:若培养后试管呈现浑浊状态.判定为有菌生长.从无菌生长的各管中找出最低药物浓度的试管.该管的药物浓度，即为最低抑菌浓度.
