1、ICS 67.120.30 B 50 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 17782013 鱼类链球菌病诊断技术规范 The norm of diagnosis technique for streptococcicosis in fish 2013 - 09 - 05发布 2013 - 09 - 30实施河北省质量技术监督局 发 布DB13/T 17782013 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由河北省质量技术监督局提出。 本标准起草单位：河北省水产养殖病害防治监测总站。 本标准主要起草人：侯金良、张志华、马瑞欣、李同庆、孙伟彬、邵铁凡
2、、梁艳红、田洋、苏欢欢、薛政。 DB13/T 17782013 1 鱼类链球菌病诊断技术规范 1 范围 本标准规定了鱼类链球菌病的诊断方法。 本标准适用于鱼类链球菌病病原菌的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 病原菌 链球菌（Strep
3、tococcus）呈球形或卵圆形，在液体培养基中以成对或链状出现；革兰氏阳性、触媒阴性、兼性厌氧；在血平板上通常溶血。引起鱼类链球菌病的有海豚链球菌（Streptococcus iniae）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、米氏链球菌（Streptococcus millieri）、副乳房链球菌（Streptococcus parauberis）和停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）。其中海豚链球菌和无乳链球菌是引起鱼类链球菌病的主要病原菌。 4 设备和材料 设备和材料包括： a) 恒温培养箱。 b) 显微镜：10100。 c) 灭
4、菌乳钵。 d) 天平：精度0.1g。 e) 恒温水浴锅。 f) 带有热盖功能的PCR仪。 g) 电泳仪。 h) 紫外分析仪或紫外观察灯。 i) 灭菌剪刀、镊子。 j) 高压灭菌器。 DB13/T 17782013 2 5 培养基和试剂 培养基和试剂包括： a) 水：应符合GB/T 6682 的要求。 b) Todd-Hewitt肉汤（简称THB)。 c) 血琼脂平板：按GB/T 4789.28中规定。 d) 75酒精。 e) 革兰氏染色液：按GB/T 4789.28中规定。 f) 3 H2O2 溶液（临时配制）。 g) Taq DNA聚合酶。 h) 酚/氯仿/异戊醇（25241）。 i) 琼脂
5、糖。 j) 溴化乙锭（EB）。 k) 标准菌株：海豚链球菌和无乳链球菌标准菌株。 l) dNTP：含dATP、dCTP、dGTP和dTTP各10mmol/L。 m) PCR引物： 本标准以链球菌延伸因子（EF-Tu）tuf基因设计一对引物。扩增片段大小为639bp。使用时浓度为10mol/L。其序列如下： E1: 5GGACCAATGCCACAAACTCG3 E2: 5TGGAGTATGACGTCCACCTTC3 n) DNA分子质量标准（Marker）。 o) 无水乙醇：使用前预冷至-20。 6 诊断步骤 6.1 活动情况观察 患病鱼游动缓慢，缺乏活力，分散于缓流处，浮于水面，或头向上尾向下
6、呈悬垂状；临死前，病鱼或间断地狂游、翻滚、转圈。 6.2 外部检查 患病鱼单侧或双侧眼球突出、充血，角膜混浊；体色发黑，肛门红肿；鳃贫血，鳃盖下缘、胸鳍基部有出血现象；体表有l处或多处隆起，尤以尾部为多见，隆起部位出血或溃疡。 6.3 解剖检查 患病鱼脑部充血，有出血点；肝脏肿大、出血，或脂肪变性、褪色；脾脏肿大，呈暗红色；胆囊、肾脏肿胀；胃肠或腹腔积水，肠壁充血发炎。 6.4 病原菌的实验室常规鉴定 6.4.1 涂片检查 用75%酒精棉球擦拭鱼体，在无菌条件下取样品鱼的脑、肾、肝、脾等器官的小块组织,在洁净载玻片上涂片,风干后,革兰氏染色（按GB/T 4789.28中的规定）后镜检。如见紫色
7、球菌则表明病料中可能含有链球菌。 DB13/T 17782013 3 6.4.2 病原菌分离培养 对于有明显症状的鱼，用经火焰灭菌并冷却的接种环于病灶或内部组织无菌取材后划线接种于血琼脂平板。 对于无明显症状的鱼，在无菌条件下取样品鱼的脑、肾、肝、脾等器官共25g组织匀质,加入225mL灭菌的THB增菌液（见附录A.1）,28培养242h后，划线接种于血琼脂平板。将血琼脂平板于28培养24h士2h，如菌落生长缓慢，可延长至48h士2h后观察。 6.4.3 菌落形态和显微镜观察 在血琼脂平板上如见灰白色、圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明或不透明、直径约0.3mm1mm、溶血或无溶血的
8、菌落，则为可疑菌落。通过镜检如见成对或呈链状排列的圆形或近圆形、直径大小为0.2m1.0m的细菌，则可初步鉴定为链球菌。 6.4.4 病原菌生化鉴定 将可疑菌落做革兰氏染色、过氧化氢酶试验和葡萄糖发酵试验（按GB/T 4789.28中的规定），并将菌落接种于营养肉汤（见附录A.2）于10培养48h，观察是否生长。 如革兰氏染色呈阳性，过氧化氢酶试验阴性，葡萄糖发酵试验阴性，10营养肉汤培养不生长，则可鉴定为链球菌。 6.5 病原菌的聚合酶链式反应（PCR）方法鉴定 本方法与6.4的方法可任选其一。 6.5.1 取样 解剖待检样品鱼，取脑、肾、肝和脾组织约1.0g，于灭菌乳钵中充分研磨, 再加5
9、.0mL TE缓冲液(见附录A.3)混匀, 然后将组织悬液转入无菌离心管中。 6.5.2 模板DNA的制备 取组织悬液90L于1.5mL离心管中，加入溶菌酶 10L(10 mg/mL), 37 水浴 1 h。加入蛋白酶K 5L(20 mg/mL), 37 水浴 1h，加入 RNA 酶 10L(10 mg/mL), 37 水浴 30min,加入150L苯酚氯仿异戊醇(25241)混合液抽提3次，然后加入预冷的无水乙醇， 12000 r/min离心 10 min，弃上清，自然干燥，用100L TE缓冲液溶解做为PCR反应模板DNA溶液，4 保存。 也可以使用能够达到同种效果的商业化细菌DNA提取试
10、剂盒。 6.5.3 PCR扩增 PCR反应体系50L，10PCR buffer 5L，MgCl2 （25mmol/L）4L，dNTPs（各10mmol/L）1L，E1、E2引物（10molL）各1L，Taq DNA聚合酶（5/L）0.5L，模板DNA溶液2L，双蒸水35.5L。PCR反应条件为：94预变性 5 min；94变性 1 min，58退火 45 s，72延伸 1 min，共 35 循环；72延伸 10 min，最后4保温。 每次反应应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。 将海豚链球菌或无乳链球菌标准菌株分别接种于THB增菌液中，28培养18h24h，摇匀后取1mL，用无菌生理盐水稀释至
11、106108CUF/mL（约麦氏比浊度0.4），按 6.5.2 的方法提取细菌DNA做为PCR反应的阳性模板。以DNA提取液代替阴性对照模板。以水替代空白对照模板。 DB13/T 17782013 4 PCR扩增反应试剂也可以使用能够达到同种效果的商业化PCR扩增试剂盒。 6.5.4 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 用电泳缓冲液（见附录A.4）配制1.5%的琼脂糖含0.5g/mL EB溶液平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好没过胶面。将6L样品和2L上样缓冲液（见附录A. 6 ）混匀后加入样品孔，同时加入DNA标准分子量（Marker）。5V/cm电泳约45min，当溴酚蓝达到底部时停止。
12、6.5.5 结果观察与判定 用紫外分析仪或紫外观察灯观察琼脂糖凝胶； 阳性对照样会在与Marker相应的639bp片段的位置出现条带，阴性对照和空白对照应无条带； 如在639bp位置出现条带，则判定为链球菌阳性； 如在639bp位置无条带，或条带不在此位置，则判定为链球菌阴性。 7 综合判定 具有6.1、6.2、6.3全部或部分症状，并且病原菌经6.4或6.5鉴定为链球菌，判定为鱼类链球菌病。 DB13/T 17782013 5 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂配制 标准中所用试剂，除特别注明外，均采用分析纯试剂。 A.1 Todd-Hewitt肉汤（简称THB) 牛肉膏 5.0g 胰
13、蛋白胨 20.0g 葡葡糖 2.0g 碳酸钠 2.5g 氯化钠 2.0g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 0.4g 蒸馏水 1000ml 将以上各成份混合煮沸，完全溶化，冷却至室温后，调pH，于115灭菌10min，最终pH为7.8。 A.2 营养肉汤 蛋白陈 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL 按上述成分混合，溶解后校正pH至7.4，分装，每瓶225mL，121高压灭菌15min。 A.3 1TE 缓冲液 1M Tris-HCl（PH=8.0） 5ml 0.5M EDTA（PH=8.0） 1ml 量取以上溶液于500ml烧杯中，向烧杯中加入约400mL重蒸水均匀混合；将溶
14、液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存。 A.4 5TBE电泳缓冲液 Tris 54g 硼酸（HBO3 ） 27.5g EDTA 2.922g 水 1000mL 用5mol/L盐酸（HCl）调到pH 8.3，用时稀释10倍。 DB13/T 17782013 6 A.5 EB(ethidium bromide，核酸染色剂) 用水配制成10mg/mL的浓缩液，用时每10mL电泳液或琼脂糖中加1L。 A.6 上样缓冲液 每100mL水溶液中含溴酚蓝0.25g，蔗糖40g。 DB13/T 17782013 7 B B 附 录 B （资料性附录） 链球菌（EF-Tu）tuf基因序列 B.1 无乳链
15、球菌延伸因子（EF-Tu）tuf基因序列 1 ggaccaatgc cacaaactcg tgagcacatc cttctttcac gtcaagttgg tgttaaacac 61 cttatcgtat tcatgaacaa agttgacctt gttgatgatg aagaattgct tgaattggtt 121 gaaatggaaa ttcgtgacct tctttcagaa tacgacttcc caggtgatga ccttccagtt 181 atccaaggtt cagctcttaa agcacttgaa ggcgacgaaa aatacgaaga catcatcatg 24
16、1 gaattgatga gcactgttga tgagtacatt ccagaaccag aacgtgatac tgacaaacct 301 ttacttcttc cagttgaaga tgtattctca atcactggac gtggtacagt tgcttcagga 361 cgtatcgacc gtggtactgt tcgtgtcaac gacgaagttg aaatcgttgg tattaaagaa 421 gatatccaaa aagcagttgt tactggtgtt gaaatgttcc gtaaacaact tgacgaaggt 481 cttgcagggg acaacgt
17、tgg tgttcttctt cgtggtgttc aacgtgatga aatcgaacgt 541 ggtcaagttc ttgctaaacc aggttcaatc aacccacaca ctaaatttaa aggtgaagtt 601 tacatccttt ctaaagaaga aggtggacgt catactccat tcttcaacaa ctaccgtcca 661 caattctact tccgtacaac tgacgtaaca ggttcaatcg aacttccagc aggaacagaa 721 atggttatgc ctggtgataa cgttactatc gaagt
18、tgaat t / B.2 海豚链球菌延伸因子（EF-Tu）tuf基因序列 1 ggaccaatgc cacaaactcg tgagcacatc cttctttcac gtcaagttgg tgttaaacac 61 cttatcgttt tcatgaacaa aattgacctt gttgatgatg aagaattgct tgaattagtt 121 gaaatggaaa tccgtgatct tctttcagaa tacgatttcc caggtgatga ccttccagtt 181 atccaaggtt cagctcttaa agctcttgaa ggcgatgaaa aatacga
19、aga catcgttatg 241 gaattgatgg ctactgttga ttcatacatt ccagaaccag aacgtgatac tgacaaacca 301 ttgcttcttc cagttgagga tgtattctca atcactggac gtggtactgt tgcttcagga 361 cgtatcgacc gtggtactgt tcgtgtcaac gacgaaatcg aaatcgttgg tattaaagaa DB13/T 17782013 8 421 gaaactcaaa aagctatcgt tactggtgtt gaaatgttcc gtaaacaac
20、t tgacgaaggt 481 cttgcaggag acaacgtagg tatccttctt cgtggtgttc aacgtgacga aatcgaacgt 541 ggacaagtta ttgctaaacc aggttcaatc aacccacata ctaaatttaa aggtgaagta 601 tacatccttt ctaaagaaga aggtggacgt catactccat tcttcaacaa ctaccgccca 661 caattctact tccgtacaac tgacgtaaca ggttcaatcg aacttccagc aggtacagaa 721 atggttatgc ctggtgataa cgtgacaatc aacgttgagt t / _
