1、ICS 65.020.30 B 41 DB13 河北省 地方标准 DB13/T 2609 2017 禽流感病毒与新城疫病毒二重 RT-PCR 检测方法 2017 - 11 - 22 发布 2017 - 12 - 22 实施 河北省质量技术监督局 发布 DB13/T 2609 2017 I 前 言 本标准 按照 GB/T 1.1-2009给出 的规则起草。 本标准由河北农业大学提出。 本标准起草单位：河北农业大学。 本标准主要起草人：袁万哲、刘聚祥、陈立功、孙继国、董世山、武现军、刘静、张磊、李睿文 、李丽敏、白云 、韩庆安 。DB13/T 2609 2017 1 禽流感病毒与新城疫病毒二重 R
2、T-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了禽流感病毒与新城疫病毒 RT-PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽流感病毒与新城疫病毒。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EB：溴化乙锭（ ethidium bromide） DEPC：焦碳酸二乙酯（ diethypyrocarbonate） PCR：聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction） RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid） RT-PCR：反转录 -聚合酶链式反应（ reverse-transcription polymeras
3、e chain reaction） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（ deoxy-ribonucleoside triphosphate） 3 试剂或 材料 包括 LS TRIzol RNA提取试剂或各种市售病毒核酸提取试剂盒，氯仿，异丙醇， 75%乙醇， 1.0琼脂糖凝胶， 50 TAE缓冲液，溴化乙锭（ EB， 10 ug/L）或核酸染料，焦碳酸二乙酯（ DEPC）处理的灭菌的双蒸水， DNA分子量标准（ 100 bp）， 2Taq MasterMix。 警示 :氯仿属中等毒性，在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗；电泳中用到的 EB在操作中应戴手套和口罩。
4、试验中被 EB污染的物品要进行无害化处理； DEPC在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。 3.1 LS TRIzol RNA 提取试剂或病毒核 酸提取试剂盒。 3.2 氯仿 :又名三氯甲烷。 3.3 1.0琼脂糖凝胶，配制 方法 见附录 A 中 A.1。 3.4 50 TAE 缓冲液，配制 方法 见附录 A 中 A.2。 3.5 溴化乙锭（ EB， 10 ug/ L）或核酸染料，配制 方法 见附录 A 中 A.3。 3.6 焦碳酸二乙酯（ DEPC）处理的灭菌的双蒸水，配制 方法 见附录 A 中 A.4。 3.7 DNA 分子量标准（ 100 bp） :包
5、含 100 bp、 250 bp、 500 bp、 750 bp、 1000 bp、 2000bp 几种分子量标准。 3.8 反转录酶 :M-MLV 反转录酶（ 200 U/ L）或 AMV 反转录酶（ 10 U/ L） 。 DB13/T 2609 2017 2 3.9 RNA 酶抑制剂。 3.10 2Taq MasterMix :含有 PCR 缓冲液、酶混合物、 dNTP 混合物、无 RNA 酶的水等。 3.11 dNTP。浓度为 2.5mM。 3.12 引物 :反转录引物、上游引物与下游引物见附录 B 中 的表 B.1。引物浓度为 10 mol/L。 4 仪器设备 4.1 PCR 仪 :温
6、度范围 4.0 99.9 ,样品基座配置至少包括单个 0.2 mL 孔。 4.2 凝胶成像系统 :检测灵敏度 DNA 0.1ng；有效像数 1360 1024、 10 bit、 USB 2.0。 4.3 台式低温高速离心机 :最高转速 16000 r/min； 容量 1.5 mL 12。 4.4 电泳仪 :电压 50 V 120 V，电流 10 mA 800 mA，定时 0 min 999 min。 4.5 电泳槽 :耐高温、耐腐蚀、不漏液；缓冲液容量充足。 4.6 冰箱 :具有冷藏功能。 4.7 微量移液器 :单道可调 ,量程包括 0.5 L 10 L、 2 L 20 L、 10 L 100
7、 L、 100 L 1000 L。 4.8 水浴锅 :温度范围 为 室温 100。 5 样品 5.1 阴阳性对照 以灭活的禽流感病毒与新城疫病毒 鸡胚培养物 或者感染禽组织作为阳性对照，以正常 鸡胚尿囊液或者是正常家禽组织作为阴性对照。对照均应在 -20保存。 5.2 样品的采集与处理 5.2.1 采集工具 下列的采集工具应经 121 2， 20 min高压灭菌并烘干： a) 棉拭子； b) 剪刀； c) 镊子； d) 1.5 mL 离心管； e) 研钵。 5.2.2 棉拭子采集 将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有 1.0 mL PBS（配制 方法 见附录 A中 A.5）的
8、 1.5 mL的离心管，加盖，编号。 5.2.3 组织采集 DB13/T 2609 2017 3 剖检家禽 ，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织，装入一次性灭菌容器，编号。 5.2.4 样品储运 样品采集后放入塑料 袋 内 密封 （一个采集点的样品放一个塑料 袋 内），于保温箱中加冰，密封 24 h内送至实验室。 5.2.5 样品的处理 5.2.5.1 棉拭子处理方法 将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出， 4条件下 3000 r/min离心 15 min，取上清液转入无菌的 1.5 mL离心管中，编号备用。 5.2.5.2 组织的处理方法 将所采集的组织
9、至于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（ 1:5）加入样品保存液进行充分研磨， 4 条件下 3000 r/min离心 15 min。取上清转入无菌的 1.5 mL的离心管备用，编号。 6 操作步骤 6.1 RNA 的提取 6.1.1 用 LS TRIzol 试剂提取待检样品（棉拭子或组织）、阳性对照及阴性对照样品的 RNA。 6.1.2 将 250 L 经过预处理的待检样品（棉拭子或组织）加入 750 L TRIzol LS Reagent 中，振荡 2 min，室温放置 5 min。 6.1.3 加入 250 L 氯仿，在微量振荡器上振荡 1 min，室温放置 5 min 后
10、， 4条件下 12000 r/min离心 15 min。 6.1.4 吸取上层水相转入一新的离心管中，加入 等量的异丙醇，混匀，室温放置 15 min， 4条件下12000 r/min 离心 15 min。 6.1.5 小心吸弃上清，加入 DEPC 处理的 75%乙醇 700 L 800 L， 4条件下 12000 r/min 离心 5 min。 6.1.6 小心吸弃上清，将沉淀自然风干或于 50干燥箱中晾干，加适量的 DEPC 水溶解。 6.1.7 提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增，若需长期保存，应至于 -80的冰箱保存。 6.1.8 也可采用商品化的病毒核酸提取试剂
11、，按照说明书进行如下操作。同时进行阴阳对照样品 RNA的提取。 6.1.8.1 加入 20 L 蛋白酶 K 于 1.5 mL 离心管中，在离心管中加入 200 L 样品，加入 200 L BB5，涡旋混合 15 s， 56孵育 15 min。 6.1.8.2 加入 250 L 无水乙醇，涡旋混合 15 s，室温放置 5 min。 6.1.8.3 将溶液和沉淀一起加入离心柱中， 12000 r/min 离心 1min，弃掉流出液。 6.1.8.4 加入 500 L WB5， 12000 r/min 离心 1min，弃掉流出液，重复一次。 DB13/T 2609 2017 4 6.1.8.5 室温
12、 12000 r/min 离心 1min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置 1 3 min 彻底晾干离心柱。 6.1.8.6 将离心柱转入 1.5 mL 离心管中，并向离心柱中央加 20 L RNase-free Water，室温静置1min。 6.1.8.7 室温 12000 r/min 离心 1min，洗脱 RNA。 6.1.8.8 提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增，若需长期保存，应至于 -80的冰箱保存。 6.2 RT-PCR 6.2.1 反转录反应（ cDNA 的合成） 取上述步骤所得的 RNA 11 L，加入 2 L 10 mol/L的反转录引物（ AIV/ND
13、V-RT）， 4 L 5反转录缓冲液、 0.5 L反转录酶、 0.5 L RNA酶抑制剂、 2 L dNTP Mixture至 20 L， 42水浴 1 h，即得到 cDNA溶液 ，直接用于下面的 PCR扩增或 -20冻存备用。 6.2.2 PCR 反应 在反应管中依次加入 8 L无核酸酶水、 10 L 2Taq MasterMix 、 1 L上述 cDNA溶液、各 0.5 L 10mol/L的上游引物（ AIV-decF与 NDV-decF）、各 0.5 L 10 mol/L的下游引物（ AIV-decR与 NDV-decR）。经充分混匀后瞬时 离心使液体全部聚集于管底。 PCR扩增条件：
14、94预变性 3 min， 94变性 10 s， 56退火 30 s， 72延伸 25 s，循环 30次； 72延伸 5 min。扩增反应结束后立即进行电泳或置于 4条件下备用。 7 试验数据处理 7.1 扩增产物的电泳检测 制备 1.0%琼脂糖凝胶板。在电泳槽内加入 1 TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取 3 L 5 L扩增产物加到凝胶孔，加入 DNA分子量标准 （ 100 bp） 。恒压（ 110V）电泳 30 min 40 min，将 电泳 好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。 7.2 结果判定 阳性 对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带，阴性的扩增产物没
15、有预期的目的条带，阴阳性同时成立表明试验有效，否则试验无效。在试验结果成立的前提下，如果样品的 RT-PCR产物电泳后在 428 bp位置出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒核酸检测阳性；如果样品的 RT-PCR产物电泳后在 297 bp位置出现特异性的条带，则判定为新城疫病毒核酸检测 阳 性。如果样品的 RT-PCR产物电泳后在 428 bp和 297 bp位置均出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒与新城疫病毒核酸检测双阳性；如果样品的 RT-PCR产物电泳后在 428 bp和 297bp位置均未出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒与新城疫病毒核酸检测双阴性。 RT-PCR产物电泳图见附录
16、C中 C.1。 8 试验报告 依次陈述试验对象、所使用的标准（包括发布或出版年号）、所使用的方法、检测结果与试验时间等。 DB13/T 2609 2017 5 A A 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 1.0%琼脂糖凝胶 称取琼脂糖 1.0 g，放入 100 mL 1 TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至 60时，加入 5 L核酸染料，均匀铺板，厚度为 3 mm 5 mm。 A.2 50 TAE电泳缓冲液 A.2.1 0.5 mol/L EDTA溶液（ pH 8.0） 称取 EDTA 18.61 g，加灭菌双蒸水至 100 mL，后用氢氧化钠调 pH至 8.0。 A.2.2
17、 TAE电泳缓冲液（ 50） Tris 242 g，冰乙酸 57.1 mL， 0.5 mol/L EDTA 100 mL，加灭菌双蒸水至 1000 mL。 A.3 溴化乙锭（ EB）溶液 溴化乙锭 20 mg，加灭菌双蒸水至 20 mL。 A.4 DEPC水 焦碳酸二乙酯（ DEPC） 50 L，加灭菌双蒸水至 100 mL，室温放置 6 h 8 h， 121 2高压灭菌 20 min，分装到 1.5 mL DEPC处理过的离心 管。 A.5 PBS缓冲液 A.5.1 A液（ 0.2 mol/L磷酸二氢钠水溶液）： NaH2PO4 H2O 27.6 g先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至 1
18、000 mL。 A.5.2 B液（ 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液）： Na2HPO4 7H2O 53.6 g，（或 Na2HPO4 127H2O 71.6 g或 Na2HPO4 2H2O 35.6 g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至 1000 mL。 A.5.3 0.01 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液的配制： A液 14 mL， B液 36 mL，加氯化钠（ NaCl） 8.5 g，最后用 蒸馏水稀释至 1000 mL。 DB13/T 2609 2017 6 B B 附 录 B （规范性附录） 引物 表 B.1规定 了 引物 的浓度和序列。 表 B.1 引物的浓度和序列
19、 引物名称 引物浓度 序列（ 5- 3） AIV-decF 10 mol/L CGT AGA CGC TTT GTC CAG AAT GC AIV-decR 10 mol/L GTC CTC ATT GCC TGC ACC ATC NDV-decF 10 mol/L CGA AGA GCC CGT TAG TCA AAT C NDV-decR 10 mol/L GTA TCT TGG CAA CCT GGG GAG AIV/NDV-RT 10 mol/L AGC AAA AGC AGG DB13/T 2609 2017 7 C C 附 录 C （规范性附录） 禽流感病毒与新城疫病毒 RT-PCR 产物电泳图 说明 ： M DNA 分子量标准（ 100bp）； 1 阴性对照； 2 禽流感病毒与新城疫病毒双阳性对照； 3 新城疫病毒阳性对照； 4 禽流感病毒阳性对照。 图 C.1 禽流感病毒与新城疫病毒 RT-PCR 产物电泳图 _ 1 M 2 3 4 bp 250 500
