1、ICS 11.220 B 41 DB13 河北省 地方标准 DB 13/T 2650 2018 奶牛结核病防治技术规范 2018 - 03 - 13 发布 2018 - 04 - 13 实施 河北省质量技术监督局 发布 DB13/T 2650 2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由唐山市质量技术监督局提出。 本标准起草单位：唐山市动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：张 军、路广计、刘志勇、张子佳、刘乃强、李 颖、陶茂辉、周忠良、张晓利、姜得英、王爱军、李玉文、冒银祥、 周建颖、董长兴、齐 彪、 张 芳 。DB13/T 2650 2018 1
2、 奶牛结核病防 治 技术规范 1 范围 本 标准 规定了 奶 牛结核病 的 诊断、 检测、 预防、 控制 等 。 本 标准 适用于 奶 牛 结核病防 治 ，其他牛参照执行 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18645-2002 动物结核病诊断技术 GB/T 27639 结核病病原菌实时荧光 PCR 检测方法 NY/T 1169 畜禽场环境污染控制技术规范 NY/T 1567 标准化奶 牛场建 设 规范 NY 5047 无公害食品 奶牛饲养
3、兽医防疫准则 农医发 2017 25 号 病死及病害动物无害化处理技术规范 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本 文件 。 3.1 奶牛结核病污染场 指奶牛结核病阳性检出率在 1 %以上或有临床病例的奶牛养殖场。 3.2 奶牛结核病控制场 指 连续 2年以上 奶牛结核病 个体阳性 检出 率在 1 %以下，所有 阳性牛 均已扑杀 ，且无临床病例发生的 奶牛养殖场 。 3.3 奶牛结核病稳定控制场 指连续 2年以上 奶牛结核病 个体阳性 检出 率在 0.2 %以下，所有 阳性牛 均已扑杀 ，且无临床病例发生的奶牛养殖场 。 3.4 奶牛结核病净化场 DB13/T 2650 2018 2 指连续
4、2年以上未检出奶牛结核病阳性病例，且无临床病例发生的奶牛养殖场 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 AvPPD： 禽型结核菌素； BPPD： 牛型结核菌素 ； PPD：提纯蛋白衍生物，提纯结核菌素； PCR：聚合酶链式反应； PBS：磷酸盐缓冲液； Elisa：酶联免疫吸附试验。 5 诊断 5.1 流行特点 结核病 奶牛最易感染，其次为黄牛、牦牛。结核病病牛 是本病的主要传染源。牛型结核分枝杆菌随鼻汁、痰液、粪便和乳汁等排出体外，健康牛可通过被污染的空气、饲料、饮水等经呼吸道、消化道等途径感染。 5.2 临床症状 潜伏期一般为 10 d 45 d，有的可长达数月或数年，以肺结核、乳房结
5、核和肠结核最为常见 ,主要症状如下： a) 肺结核 ： 以长期顽固性干咳为特征，且以清晨最为明显。患畜容易疲劳，逐渐消瘦，病情严重者可见呼吸困难。 b) 乳房结核：一般先是乳房淋巴结肿大，继而后方乳腺区发生局限性或弥漫性硬结，硬结无热无痛，表面凹凸不平。泌乳量下降，乳汁变稀，严重时乳腺萎缩，泌乳停止。 c) 肠结核 ：消瘦，持续下痢与便秘交替出现，粪便常带血或脓汁。 5.3 剖检变化 在肺脏、乳房和胃肠粘膜等处形成特异性白色或黄白色结节。结节大小不一，切面干酪样坏死或钙化，有时坏死组织溶解和软化，排出后形成空洞。胸膜和肺膜可发生密集的结核结节，形如珍珠状。 5.4 实验室诊断 5.4.1 诊断
6、方法 5.4.1.1 细菌学检查 按 GB/T 18645-2002第 3章规定执行。 5.4.1.2 结核分枝杆菌 PPD 皮内变态反应试验 按 GB/T 18645-2002第 4章规定执行。 5.4.1.3 实时荧光 PCR 检测 DB13/T 2650 2018 3 按 GB/T 27639规定执行。 5.4.1.4 牛结核病 -干扰素 Elisa 试验 按 附录 A进行 。 5.4.2 结果 判定 5.4.2.1 临床判定 根据 5.1、 5.2和 5.3做出初步 判定 。 5.4.2.2 实验室判定 5.4中任一诊断方法结果为阳性的判为奶牛结核病阳性。 5.5 检测 5.5.1 检
7、测比例 5.5.1.1 净化场按发现疫病的抽样方式确定检测比例。 5.5.1.2 稳定控制场、控制场、污染场 100 %检测。 5.5.2 检测频率 5.5.2.1 奶牛结核病净化场和稳定控制场，每年至少监测一次。 5.5.2.2 奶牛结核病控制场每年至少监测二次，间隔至少 5 个月以上。 5.5.2.3 奶牛结核病污染场每季度监测一次。 5.5.2.4 初生犊牛应于 20 日龄时进行第一次监测。 6 预防 6.1 防疫条件 6.1.1 奶牛场建设、布局等按 NY /T 1567 执行。 6.1.2 奶牛场环境控制按 NY/T 1169 执行。 6.1.3 奶牛饲养、兽医防疫按 NY 5047
8、 执行。 6.2 生物安全 6.2.1 奶牛繁育 使用的精液、胚胎来源于结核病净化种群，附有官方出具的检测阴性证明。 6.2.2 场内禁止屠宰或解剖牛只；粪便、污水及其他污物及时清理并进行无害化处理。 6.2.3 定期杀灭吸血昆虫和鼠类等啮齿动物。 6.2.4 限制外来车辆、人员入场，必需进入时应经消毒，但禁止进入生产区。 6.2.5 禁止人畜混居，不得混养其他畜禽，并防止周围其他畜禽进入。 DB13/T 2650 2018 4 6.3 人员要求 直接从事奶牛 场工作 的人员应取得卫生部门发放的健康证明。 7 控制 7.1 疫情报告 任何单位和个人发现疑似病牛，应当及时向 当地兽医主管部门 、
9、动物卫生监督机构或者动物疫病预防控制机构报告 。 7.2 阳性牛处理 按 病死及病害动物无害化处理技术规范 规定执行。 DB13/T 2650 2018 5 附 录 A （ 规范 性附录） 牛结核病 -干扰素 Elisa 试验 A.1 试验材料 A.1.1 牛结核分枝杆菌 -干扰素检测试剂盒； A.1.2 肝素钠真空采血管； A.1.3 牛型提纯结核菌素（ PPD）和禽型提纯结核菌素（ PPD）； A.1.4 常用化学试剂： 95%乙醇、 88%磷酸； A.1.5 仪器设备：酶标仪、洗板机、微 量移液器、低温离心机、培养箱、微量振荡器。 A.2 试验方法 A.2.1 全血采集及培养 A.2.1
10、.1 采血 无菌采集至少 5ml血液放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。室温（ 22 5 ，避免温度过高或过低）下运送到实验室并在采血后 24h内进行培养。避免血液冷冻和冷藏。 A.2.1.2 血液分装 分装应在 无菌条件下进行操作。 分装前轻轻颠倒试管，充分混匀血液样品。由于本试验需要活的淋巴细胞，因此需要将细胞损伤降至最低。将抗凝血加入 24孔组织培养板，每头动物加三管 1.5mL分装的抗凝血 ,见表 A.1。 表 A.1 吸取血液或抗原至 24 孔培养板的推荐操作 动物编号 试剂 1 号动物 bPPD 1 AvPPD 1 PBS 1 2 号动物 bPPD 2 AvPPD
11、2 PBS 2 3 号动物 bPPD 3 AvPPD 3 PBS 3 4 号动物 bPPD 4 AvPPD 4 PBS 4 5 号动物 bPPD 5 AvPPD 5 PBS 5 6 号动物 bPPD 6 AvPPD 6 PBS 6 7 号动物 bPPD 7 AvPPD 7 PBS 7 8 号动物 bPPD 8 AvPPD 8 PBS 8 A.2.1.3 加入刺激抗原 DB13/T 2650 2018 6 在 无菌条件下 ， 加入 100L PBS、 bPPD和 AvPPD至相应的孔。抗原必须与分装的血液充分混匀，最好用一个微量振荡器高速振荡 1min。如无合适的仪器，将细胞培养板及其盖紧紧固定
12、在一起，在光滑的表面上顺时针和逆时针各旋转 10次。小心操作不要引起交叉污染，也不要让血液附在盖上。避免血液起泡。只有刺激抗原与血液完全混合，试验才能达到最佳效果。 A.2.1.4 孵育 将含有血液和抗原的组织培养板在 37 湿温培养箱 中孵育 16h 24h。 A.2.1.5 血浆样品的收获 用可调移液 器小心吸取约 400L的上层血浆，转入独立的 1.5mL离心管中。吸取血浆时应尽量避免吸入细胞。污染极少量红细胞不会影响 -干扰素酶免疫试验。 A.2.1.6 血浆的贮存 血浆可在 2 8 贮存 7天，在 -20 可贮存几个月。贮存前，每个贮存管 应 用合适的盖子密封。在样品架上标记日期、操
13、作者的首字母、管内容物、动物编号和牛群细节等相关信息。检测前，样品应 恢复至室温并充分混匀。 A.2.2 检测 A.2.2.1 试剂准备 A.2.2.1.1 ELISA 板 未开封前，在室温平衡至少 1h。 A.2.2.1.2 阴阳性对照 用无菌蒸馏水或去离子水溶解，确保完全溶解，溶解后的阴阳性对照可在 2 8C保存 3个月。使用前恢复至室温，并充分混匀。 A.2.2.1.3 洗液 使用前恢复至室温，用蒸馏水或去离子水 20 倍稀释。 A.2.2.1.4 稀释液 直接使用，使用前恢复至室温，主要用于稀释酶标结合物。 A.2.2.1.5 结合物 用稀释液 50 倍稀释，现用现配，适量配制。 见表
14、 A.2。 表 A.2 结合物和稀释液体积 ELISA 板 结合物体积 稀释液体积 1 200l 9.8ml 2 400l 19.6ml 3 600l 29.4ml 4 800l 39.2ml 5 1000l 49ml A.2.2.1.6 TMB DB13/T 2650 2018 7 直接使用，使用前恢复至室温。 A.2.2.1.7 终止液 直接使用，使用前恢复至室温。 A.2.2.2 注意事项 A.2.2.2.1 实验前除结合物外，其它试剂与试验样品必须恢复至室温。 A.2.2.2.2 试剂盒所有试剂需 2 8 保存，用完后应立即放回 2 8 保存。 A.2.2.2.3 用无菌蒸馏水或去离子
15、水充分溶解冻干物质，溶解后平衡至少 15min，使用前 混匀。 A.2.2.2.4 待检上清应先加到稀释板，然后用 8 道或 12 道的移液器转到 ELISA 板上，保证加入的上清孵育 时间一致。 A.2.2.2.5 阴性和阳性 -干扰素对照品和空白对照每次应加入到固定孔中，在第 H 行的 10， 11 和12 孔。 A.2.2.2.6 每个板条应做好标记，并适当固定板条，以防板条从板框中脱落，或防止脱落后板条顺序混乱不清，对检测造成不必要的麻烦。 A.2.2.2.7 未用完的板条应放入含干燥剂的自封袋中 2 8 保存。如保存得当可保存至有效期止。不可混用不同批次试剂盒的板条。 A.2.2.3
16、 操作步骤 A.2.2.3.1 试验前将所有试剂（除结合物）恢复至 21 3 。 A.2.2.3.2 溶解冻干试剂，并平衡 15 min。 A.2.2.3.3 每孔加入 100 L 待检样品（不需稀释）和对照品（阳性、阴性和空白对照各一孔，阴性对照加入到 H10 孔，阳性对照加入到 H11 孔，空白对照 H12 孔）至相应孔中。在微量振荡器上振荡 1min，彻底混匀。 A.2.2.3.4 封板，室温 21 3 孵育 1h。 A.2.2.3.5 洗涤 4 次。洗液按配制方法制备，洗涤方法如下：迅速翻转 ELISA 板以倒空其内液体，避免孔与孔之间的液体混合，每孔中添加 300 l 的洗液，轻摇微
17、孔板，避免造成不同孔间的污染，迅速翻转 ELISA 板以倒空其内液体，重复操作 3 次。第 4 次洗涤完毕后，将酶标板放在干净的滤纸上拍打几次，尽量除去残留的洗液。 A.2.2.3.6 每孔加入 100 L 新鲜配制的酶标结合物，充分振荡混匀。按表 A.1 稀释液稀释酶标结合物。 A.2.2.3.7 封板，室温 21 3 孵育 1 h。 A.2.2.3.8 洗涤 4 次。洗涤方法同 4.3.5。 A.2.2.3.9 每孔加入 100 L 底物溶液（ TMB），充分振荡混合。 A.2.2.3.10 封板， 21 3 避光孵育 10min。注释：可根据颜色反应的强度延长或缩短孵育时间。 DB13/
18、T 2650 2018 8 A.2.2.3.11 每孔加入 50 L 终止液，轻轻摇动混匀。 A.2.2.3.12 终止后 5min 内读取 450nm 的 OD 值。 A.2.2.4 结果 A.2.2.4.1 试验有效性 阳性对照 OD值 大于 0.700为试验有效 ，否则试验视为失败，需重新检测。 阴性对照 OD值 小于 0.150为试验有效 ，否则试验视为失败，需重新检测。 A.2.2.4.2 结果解释 当进行重复孔时 ,OD值的计算需取平均值。 阳性和阴性的表示方法为： a)阳性 : BPPD PBS 0.1（ OD值） 且 BPPD AvPPD 0.1（ OD值）。 b)阴性 : BPPD PBS0.1（ OD值） 或 BPPD AvPPD0.1（ OD值）。 _
