1、2015-04-23发布 2015-05-01实施DBS13河 北 省 地 方 标 准DBS13/0012015食品安全地方标准食品中诺如病毒检测河北省卫生和计划生育委员会 发布DBS13/0012015I前 言本标准按GB/T1.1-2009规定的格式编写。本标准的附录A为规范性附录。本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。本标准于2015年4月23日首次发布。DBS13/00120151食品安全地方标准食品中诺如病毒检测1 范围本标准规定了贝类、生食叶类蔬菜和包装饮用水等食品中诺如病毒普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于贝类、生食叶类蔬菜和包装饮用水等食品中型和型诺
2、如病毒的检测。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。诺如病毒 norovirus诺如病毒属于人类杯状病毒科，诺如病毒属，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径约为26nm35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称。诺如病毒基因组是单股正链RNA，组成长约7kb7.5kb，电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，诺如病毒是具有典型的羽状边缘、表面有凹痕的小圆状结构病毒。诺如病毒共可分为 个基因型，其中感染人的主要是型和型。3 设备和材料3.1 电子天平：感量0.1g。3.2 组织匀浆器或其他可以破碎样品的工具。3.3 普通冰箱：28。3.4 超低温冰箱：-805
3、。3.5 高速冷冻离心机：最大离心力大于15000g。3.6 恒温水浴箱或金属浴：3765。3.7 PCR扩增仪。3.8 实时荧光PCR扩增仪。3.9 电泳仪。3.10 凝胶成像系统。3.11 震荡混匀器。3.12 电热干燥箱。DBS13/001201523.13 pH计。3.14 水过滤系统。3.15 微量可调移液器：1L10L、10L100L、100L1000L。3.16 洗耳球或电动移液器。3.17 无RNA酶的玻璃容器、微量加样器吸头、无菌50mL离心管、无菌1.5mL离心管和PCR管。3.18 无RNA酶的一次性移液管：10mL、25mL。3.19 混合硝酸纤维素膜：孔径0.22m。
4、4 试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。4.1 无RNA酶的超纯水：见附录A.1。4.2 甘氨酸缓冲液：见附录A.2。4.3 5X PEG8000溶液：见附录A.3。4.4 2.5mol/L氯化镁(MgCl2)溶液：见附录A.4。4.5 牛肉膏-甘氨酸洗脱液:见附录A.5。4.6 氯仿。4.7 1mol/L盐酸溶液。4.8 1mol/L 氢氧化钠溶液。4.9 病毒RNA提取试剂盒。4.10 TaqDNA聚合酶：-20保存，避免反复冻融。4.11 逆转录酶：-20保存，避免反复冻融。4.12 RNA酶抑制剂：-20保存，避免反复冻融。4.13 dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP
5、、dTTP各10mmol/L。4.14 引物和探针：使用浓度为25mol/L，-20保存，引物和探针序列见表1和表2。表1 普通RT-PCR检测引物检测的病毒类群 引物序列 片段大小/bpGI和GII 正向引物F:5-ATACCACTATGATGCAGATTA-3 326反向引物R:5-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3DBS13/00120153表2 实时荧光RT-PCR检测引物和探针检测的病毒类群 引物和探针序列 片段大小/bpGI 正向引物F:5-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3反向引物R:5-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3探针:5-FAM-TGG
6、ACAGGAGAYCGCRATCT-TAMRA-3 86GII 正向引物F:5-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3反向引物R:5-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3探针:5-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-TAMRA-3 894.15 1TAE：见附录A.6。4.16 分子量标记：100bp1000bp。4.17 诺如病毒阳性对照。4.18 诺如病毒阴性对照。4.19 溴化乙锭（EB）溶液（10g/L）：见附录A.7。4.20 10上样缓冲液：见附录A.8。4.21 含0.5g/mL溴化乙锭（或5%GoldView）的1.5%琼脂糖凝胶：见附
7、录A.9。5 检测程序诺如病毒检测程序见图。DBS13/00120154图1 诺如病毒检测程序6 检测步骤6.1 样品的运输与保存运输过程中保持样品温度在05。实验室接到样品后应尽快进行检测。如果暂时不能检测应将样品保存于-80冰箱中,避免样品反复冻融。6.2 样品处理和病毒富集6.2.1 贝类6.2.1.1 取样：首先用灭菌蒸馏水将贝壳表面的污泥清洗干净，打开贝壳后，倒掉腔内的液体，使用无菌的剪刀和镊子取贝类消化腺组织。6.2.1.2 按无菌操作取5g消化腺组织，在组织匀浆器中高速匀浆3min或切碎成2mm3以下的小块，放入50mL离心管中，加入35mL甘氨酸缓冲液（样品重量与缓冲液体积之比
8、为1:7），37孵育30minDBS13/00120155或室温下剧烈振荡10min。4，10000g离心30min。6.2.1.3 转移上清液至另一个50mL离心管中，加入10mL或更多氯仿，充分振荡，放置10min，4，10000g离心30min。如上清较浑浊，可重复用氯仿再抽提一次。6.2.1.4 转移上清至另一个50mL离心管中，用1mol/L盐酸调节pH至7.00.5，加入0.25倍体积的PEG8000溶液（PEG终浓度为8%），上下颠倒离心管以充分混匀。6.2.1.5 冰上放置至少1h或4放置过夜。4，10000g离心5min。弃去上清，保留沉淀。6.2.1.6 加入200L无RN
9、A酶的超纯水，60加热5min充分溶解沉淀。4，10000g离心3min，取上清，得到病毒粗提产物。6.2.2 生食叶类蔬菜6.2.2.1 使用无菌的剪刀和镊子将25g生食叶类蔬菜剪成约2.5cm2.5cm2.5cm的小块，装入50mL离心管中，加入40mL甘氨酸缓冲液，37孵育30min或室温下剧烈震荡10min，4，10000g离心30min。6.2.2.2 转移上清至另一个50mL离心管中，用1mol/L盐酸溶液调节pH至7.00.5，加入0.25倍体积的PEG8000溶液，上下颠倒离心管以充分混匀。6.2.2.3 冰上放置至少1h或4放置过夜。4，10000g离心5min。弃去上清，保
10、留沉淀。6.2.2.4 加入200L无RNA酶的超纯水，60加热5min充分溶解沉淀。4，10000g离心3min，取上清，得到病毒粗提产物。6.2.3 包装饮用水6.2.3.1 500mL水样中加入10mL的2.5mol/L氯化镁溶液，使其终浓度达到0.05mol/L；用1mol/L盐酸调节水样pH至3.00.5。6.2.3.2 采用真空抽滤使之通过孔径为0.22m的混合硝酸纤维素膜（混浊度较大的污水,需预先澄清），然后用10mL牛肉膏-甘氨酸洗脱液（pH9.5）震荡洗脱滤膜2030min。6.2.3.3 去除滤膜，用1mol/L盐酸溶液调节洗脱液pH至7.00.5，向洗脱液中加入0.25倍
11、体积的PEG8000溶液，上下颠倒离心管以充分混匀。6.2.3.4 将离心管及样液一起放在冰上放置至少1h或4放置过夜。4，10000g离心5min。弃去上清，保留沉淀。6.2.3.5 加入200L无RNA酶的超纯水，60加热5min充分溶解沉淀。4，10000g离心3min，取上清，得到病毒粗提产物。6.3 病毒RNA的提取和纯化使用病毒RNA提取试剂盒进行RNA的提取和纯化，采用如下方法，或根据仪器和试剂盒要求调整操作步骤。6.3.1 在核酸提取板每孔中加入20L磁珠混合物，加入200L病毒粗提产物，加入500L含有CarrierRNA的裂解/结合混合液，混匀后震荡5min使裂解完全。6.
12、3.2 提取板放置磁性抽提架上至少3min以捕获磁珠（捕获的时间取决于磁架的类别和型号）。当捕获完全，磁珠会在磁架上形成颗粒。DBS13/001201566.3.3 弃去上清，加入300L漂洗液1，震荡1min，在磁架上放置1min，弃去上清。6.3.4 重复上一步骤一次。6.3.5 加入450L漂洗液2，震荡1min，在磁架上放置1min，弃去上清。6.3.6 重复上一步骤一次。6.3.7 离心2min，去除漂洗液和酒精。6.3.8 加入60L室温或预热至6065的洗脱液，震荡3min，放置磁架上1min，转移上清至另一个1.5mL离心管中，-20保存纯化的RNA。注意事项：为防止RNA降解
13、，所用实验用具及溶液应无RNA酶，操作过程中应自始至终佩戴一次性橡胶或乳胶手套，并经常更换。提取后的RNA应迅速冷藏或冷冻保存，4保存不超过8h，-20保存不超过6个月，如需长期保存，应放在-805。6.4 病毒核酸检测两种方法可任选一种。6.4.1 普通RT-PCR法6.4.1.1 普通RT-PCR反应体系一步法普通RT-PCR反应体系见表3。每个反应体系设置两个平行反应。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。以诺如病毒RNA为阳性对照，以不含有诺如病毒RNA作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。表3 普通RT-PCR反应体系名称 储液浓度 终浓度 加样量/L（
14、25L体系）RT-PCR缓冲液 5 1 5.0dNTPs 10mmol/L 0.2mmol/L 0.5正向引物 25mol/L 1mol/L 1.0反向引物 25mol/L 1mol/L 1.0逆转录酶 5U/L 0.1U/L 0.5DNA聚合酶 5U/L 0.1U/L 0.5模板 5.0水（无RNA酶） 11.56.4.1.2 普通RT-PCR反应条件反应条件为：反转录 42，60min；热失活 94，10min；扩增 94，1min37，90s 40个循环72，1min延伸 74，7min。DBS13/00120157或根据试剂要求调整反应条件。6.4.1.3 PCR扩增产物的电泳检测用电
15、泳缓冲液（1TAE）、0.5g/mL溴化乙锭（或GoldView等核酸染料）配制1.5%的琼脂糖凝胶（见附录A.9）。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将9LPCR扩增产物，加1L10上样缓冲液，点样，电泳。电压根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm5V/cm，当溴酚蓝移动到凝胶边缘时关闭电源。凝胶成像系统观察电泳结果，获取并保存图像。6.4.2 实时荧光RT-PCR法6.4.2.1 实时荧光RT-PCR反应体系一步法RT-PCR反应体系见表4。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。以诺如病毒RNA为阳性对照，以不含有诺如病毒RNA作为阴性对照，以水
16、代替模板作为空白对照。表4 实时荧光RT-PCR反应体系名称 储液浓度 终浓度 加样量/L（50L体系）RT-PCR缓冲液 5 1 10.0探针 25mol/L 0.25mol/L 0.5正向引物 25mol/L 0.5mol/L 1.0反向引物 25mol/L 1mol/L 2.0RNA酶抑制剂 20U/L 10U 0.5模板 10.0水（无RNA酶） 26.06.4.2.2 实时荧光RT-PCR反应条件反应条件为：反转录 55，60min；热失活 95，5min；扩增 95，15s60，1min 45 个循环65，1min（检测荧光）或根据试剂要求调整反应条件。7 结果判定标准7.1 普通
17、RT-PCR法如果阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现一条326bp大小的条带，而样品未出现预期大小的条带，则可判定样品为诺如病毒阴性。如果阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现一条326bp大小的条带，样品也出现预期大小条带，则可判定样品为诺如病毒阳性。7.2 实时荧光RT-PCR法DBS13/00120158待测样品的Ct值大于或等于45时，则判定诺如病毒阴性。待测样品的Ct值小于或等于30时，则判定诺如病毒阳性。待测样品的Ct值小于45而大于30时，应重新进行测试，如果重测样品的Ct值大于或等于45时，则判定诺如病毒阴性；如果重测样品的Ct值小于45时，则判定诺如病毒阳性。
18、8 结果报告8.1 阴性结果报告方式若贝类检测结果为阴性，则结果报告为5g贝类消化腺未检出诺如病毒。若生食叶类蔬菜检测结果为阴性，则结果报告为25g生食叶类蔬菜未检出诺如病毒。若包装饮用水检测结果为阴性，则结果报告为500mL包装饮用水未检出诺如病毒。8.2 阳性结果报告方式若贝类检测结果为阳性，则结果报告为5g贝类消化腺检出诺如病毒。若生食叶类蔬菜检测结果为阳性，则结果报告为25g生食叶类蔬菜检出诺如病毒。若包装饮用水检测结果为阳性，则结果报告为500mL包装饮用水检出诺如病毒。DBS13/00120159附 录 A（规范性附录）试剂的配制除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。RNA酶的
19、去除和无RNA酶溶液的配制：配制溶液用的液体和固体应采用未开封的新品。配制溶液所用的超纯水、玻璃容器、移液器吸头、药匙等用具应无RNA酶。操作过程中应始终佩戴乳胶手套，并经常更换，以避免皮肤上的细菌和真菌及人体自身分泌的RNA酶污染用具或带入溶液。玻璃容器应在240烘烤4h以去除RNA酶。离心管、移液器吸头、药匙等用具可购买无RNA酶级别的，或用0.1%的焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液室温浸泡过夜，然后高压灭菌并烘干。A.1 无RNA酶的超纯水A.1.1 成分超纯水 1000.0mL焦炭酸二乙酯（DEPC） 1.0mLA.1.2 制法避光，室温搅拌过夜，121高压灭菌15min，备用。A.2
20、甘氨酸缓冲液（含0.1mol/L甘氨酸，0.3mol/L氯化钠，pH9.5）A.2.1 成分甘氨酸 7.50g氯化钠 17.55gA.2.2 制法将上述各成分搅拌溶解于超纯水中，调节pH至9.5，用超纯水定容至1000mL，分装，121高压灭菌15min，备用。A.3 5XPEG8000溶液含40%（w/v）PEG8000，1.5mol/L氯化钠A.3.1 成分PEG8000 400.0g氯化钠 87.0gA.3.2 制法将上述各成分搅拌溶解于超纯水中，用超纯水定容至1000mL，分装，121高压灭菌15min，备用。A.4 2.5mol/L氯化镁(MgCl2)溶液DBS13/00120151
21、0A.4.1 成分氯化镁（MgCl2） 238.0gA.4.2 制法将上述各成分搅拌溶解于超纯水中，用超纯水定容至1000mL，分装，121高压灭菌15min，备用。A.5 牛肉膏-甘氨酸洗脱液（含3牛肉膏,0.05mol/L甘氨酸,pH9.5）A.5.1 成分牛肉膏 30.0g甘氨酸 3.75gA.5.2 制法将上述各成分搅拌溶解于超纯水中，调节pH至9.5，用超纯水定容至1000mL，分装，121高压灭菌15min，备用。A.6 1TAE电泳缓冲液A.6.1 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液，pH8.0A.6.1.1 成分乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na22H2O
22、） 186.1gA.6.1.2 制法将上述各成分搅拌溶解于超纯水中，调节pH至8.0，用超纯水定容至1000mL，分装，121高压灭菌15min，备用。A.6.2 50TAE电泳缓冲液A.6.2.1 成分羟基甲基氨基甲烷（Tris） 242.0g冰乙酸 57.1mL0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0） 100.0mLA.6.2.2 制法将上述各成分搅拌溶解于超纯水中，定容至1000mL，分装，121高压灭菌15min，备用。A.6.3 1TAE电泳缓冲液A.6.3.1 制法使用时，将50TAE电泳缓冲液用灭菌超纯水稀释至1TAE电泳缓冲液。A.7 溴化乙锭（EB）溶液（10g/L）DBS
23、13/001201511A.7.1 成分溴化乙锭 200.0mg灭菌超纯水 20.0mLA.7.2 制法将200mg溴化乙锭加至20mL灭菌超纯水中，混匀。A.8 10上样缓冲液A.8.1 成分聚蔗糖 25.0g溴酚蓝 0.1g二甲苯青 0.1gA.8.2 制法将上述各成分搅拌溶解于超纯水中，用超纯水定容至100mL，混匀备用。A.9 含0.5g/mL溴化乙锭（或5%GoldView）的1.5%琼脂糖凝胶的配制A.9.1 成分琼脂糖 1.5g1TAE电泳缓冲液 100.0mLA.9.2 制法称取1.5g琼脂糖，加入100mL的1TAE电泳缓冲液，混合，加热至完全融化，待冷至5560时，加EB溶液（10g/L）5L（或其他核酸染料），轻轻晃动摇匀，避免产生气泡，将梳子置入制胶槽中，然后将琼脂糖溶液倒入制胶板上，待凝固后（约需30min），取下梳子备用。
