1、2015-04-23发布 2015-05-01实施DBS13河 北 省 地 方 标 准DBS13/0032015食品安全地方标准阪崎肠杆菌和沙门氏菌检测河北省卫生和计划生育委员会 发布DBS13/0032015I前 言本标准按GB/T1.1-2009规定的格式编写。本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。本标准于2015年4月23日首次发布。DBS13/00320151食品安全地方标准阪崎肠杆菌和沙门氏菌检测1 范围本标准适用于应用实时荧光定量PCR法定性检测阪崎肠杆菌和沙门氏菌。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不
2、注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验。GB4789.40 食品安全国家标准 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验。3 方法提要阪崎肠杆菌和沙门氏菌均属于肠杆菌科，本检测方法首先对肠杆菌科和阪崎肠杆菌进行同步检测。当肠杆菌科为阴性时可直接报告沙门氏菌阴性；当肠杆菌科为阳性时再进行沙门氏菌的检测；当阪崎肠杆菌为阳性时需按照GB4789.40进行确证；当沙门氏菌为阳性时需按照GB4789.4进行确证。4 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：4.1二级生物安全柜4.2 磁力搅拌器：0-
3、2400 r/min。4.3 卤素灯：500W。4.4 低温离心管架：1.5mL，0 。4.5 水浴锅或金属恒温加热器：5-100。4.6 漩涡振荡器。4.7 离心机：12000r/min。4.8 移液器及对应吸头：10L、100L、200L、1000L。4.9 超净工作台。4.10 实时荧光定量PCR仪（含有FAM-,HEX-和ROX-检测通道）。4.11 冰箱：28 和-20两种。DBS13/003201524.12 天平：感量0.1g。4.13 0.2mL 8联排管以及8联排帽（与PCR仪配套使用）。4.14 1.5mL无菌透明离心管。4.15 恒温培养箱：25 1，361 ，440.5
4、。4.16 无菌锥形瓶：容量100mL、200mL、2000mL。5 培养基和试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。5.1 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录A.1。5.2 营养肉汤培养基（NB）：见附录A.2。5.3 125g/mL溴化乙锭单叠氮溴溶液（EMA）：见附录A.3。5.4 DNA提取缓冲液:0.1%Chelex100（螯合树脂）水溶液。5.5 吐温80。5.6 按照表1和表4的序列合成的引物和标记的探针。5.7 TaqDNA聚合酶：5 U/L。5.8 TaqPCR缓冲液。5.9 50mmol/LMgCl2溶液：见附录A.4。5.10 dNTPs（dATP,dUTP,dCTP,
5、dGTP），浓度均为10mmol/L。5.11 尿嘧啶-N-糖基化酶：1U/L。5.12 pUC19质粒DNA，200拷贝/L。5.13 阪崎肠杆菌质控菌株：ATCC29544，或等效菌株。5.14 沙门氏菌质控菌株：ATCC13311，或等效菌株。5.15 大肠杆菌质控菌株：ATCC10536，或等效菌株。5.16 金黄色葡萄球菌：CICC10301，或其它非肠杆菌科的阴性质控等效菌株。6 检验程序检验程序见图1。DBS13/0032015336 1，16 h-20h图1检验程序7 操作步骤7.1 首次增菌称取样品100g（mL）加入到900mL预热至37 的BPW中，充分混匀，361培养1
6、6h20h。对于含有超过20%脂肪含量的样品，需要在BPW中加入1 g/L（每10%脂肪含量）的吐温80。7.2 二次增菌充分摇匀首次增菌液，吸取50L转种于450L预热至37的BPW中，361 培养3h4h。7.3 样品模板DNA的制备7.3.1 吸取100L二次增菌液加入到1.5mL无菌透明离心管中；加入400L EMA溶液，室温下暗室培养5min。7.3.2 将离心管放入低温离心管架中，置于500W卤素灯正下方，相距15cm-20cm，曝光5min后，10000r/min离心5min。7.3.3 用移液器移除上清液，加入200LDNA提取缓冲液，充分混匀后，置于95-100水浴锅或金属恒
7、温加热器中维持10min。7.3.4 室温下静置1min，振荡混匀，12000r/min离心2min，上清液即为DNA模板。7.4 质控菌株模板DNA的制备检样100g（mL）加入到900mL BPW中进行首次增菌50 L首次增菌样品加入到450L BPW中进行二次增菌36 1，3h-4h100L二次增菌样品加入到EMA溶液中（灭活死亡细胞的DNA）DNA的提取实时荧光定量PCR检测阴性结果报告阳性GB4789.40、GB4789.4进行确证DBS13/00320154分别接种供试的阳性对照菌株（大肠杆菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌）和阴性对照菌株（金黄色葡萄球菌）到10mLNB培养液中，36 1培
8、养过夜，各取1.5mL增菌液，同上离心、提取DNA模板。7.5 PCR反应所用引物和探针工作液的配制根据表1反应体系中每种引物和探针的终浓度，使用灭菌去离子水配制含有6种目标基因引物的工作液（浓度分别为10mol/L）和含有3种探针的工作液（浓度分别为10mol/L）。表1 目标基因引物和探针序列及每个反应体系内的终浓度引物和探针名称 序列 终浓度（mol/L）肠杆菌科-F 5-CTG AAA GCA TCT AAG CAC GAA ACT TG-3 0.4肠杆菌科-R 5-GTC GTC TTC AAC GTT CCT TCA GG-3 0.4阪崎肠杆菌-F 5-AGG GGA TAT TG
9、T CCC CTG AAA CAG-3 0.4阪崎肠杆菌-R 5-AAA CGA GAA TAA GCC GCG CAT T-3 0.4内部扩增对照（IAC）-F 5-TGT GAA ATA CCG CAC AGA TG-3 0.4内部扩增对照（IAC）-R 5-AGC TGG CGT AAT AGC GAA G-3 0.4肠杆菌科探针 5-FAM-CCCGAGATGAGTTCTCCCTGASMCTTTAAGT-BHQ-1-3 0.2阪崎肠杆菌探针 5-HEX-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ-1-3 0.2IAC探针 5-ROX-TAAGGAGAA
10、AATACCGCATCAGGCGCC-BHQ-2-3 0.27.6 模板DNA荧光PCR反应体系的配制每个样品按照表2的加液量配制25L反应体系。表2 目标基因扩增体系配制表试剂名称 加样体积（L）灭菌去离子水 12.110Taq PCR反应缓冲液 2.550mmol/L MgCl2 2.010mmol/L dNTPs 0.5引物工作液 1.0探针工作液 0.55U/LTaq DNA聚合酶 0.151U/L尿嘧啶-N-糖基化酶 0.25200 拷贝/LpUC19质粒DNA 1.0DNA模板 5.0总体积 25每次进行PCR反应均需使用pUC19 质粒DNA作为内部扩增对照，并设置阳性、阴性和空
11、白对照（灭菌去离子水）。7.7 肠杆菌科和阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR检测将配制完成的反应管放入实时荧光定量PCR仪中，按照如下步骤设置反应条件：反应步骤一：预变性，37 4 min，95 5 min，1个循环；DBS13/00320155反应步骤二：扩增和信号收集，95变性10s，65 退火和延伸（每个循环降低0.1）70s，40个循环，同时收集FAM，HEX和ROX的荧光信号。核查反应条件正确后，启动反应程序。7.8 结果判读当检测样本Ct值小于或等于35时，报告为阳性；Ct值大于35且小于40时，需要重复一次，如果Ct值仍小于40，且曲线有明显的对数增长期，报告为阳性，否则为阴性；样本没
12、有Ct值时，报告为阴性。具体结果判定参照表3。 表3 肠杆菌科和阪崎肠杆菌结果判读表肠杆菌科FAM 阪崎肠杆菌HEX 内部扩增对照（IAC）ROX 结果判读阳性 阳性 阳性或阴性 肠杆菌科及阪崎肠杆菌阳性，可能含有沙门氏菌阳性 阴性 阳性或阴性 肠杆菌科阳性，阪崎肠杆菌阴性，可能含有沙门氏菌阴性 阴性 阳性 肠杆菌科、阪崎肠杆菌及沙门氏菌阴性阴性 阴性 阴性 无效的结果当FAM通道为阳性，HEX通道为阳性时，可报告肠杆菌科和阪崎肠杆菌阳性；当FAM通道为阳性，HEX通道为阴性时，可报告肠杆菌科阳性但阪崎肠杆菌阴性；当FAM通道为阴性，HEX通道为阴性，ROX通道为阳性时，可报告肠杆菌科和阪崎肠
13、杆菌阴性；当FAM通道，HEX通道和ROX通道均为阴性时，为无效的结果应重做实验。当肠杆菌科和阪崎肠杆菌均为阴性时，可报告沙门氏菌阴性；当肠杆菌科为阳性时，需要按下一步骤进一步单独确证样本中是否含有沙门氏菌。7.9 沙门氏菌的确证实验DNA模板可直接采用7.3已制备的样品DNA模板。7.9.1 PCR反应所用引物和探针工作液的配制根据表4反应体系中每种引物和探针的终浓度，使用灭菌去离子水配制含有4种目标基因引物的工作液（浓度分别为10mol/L）和含有2种探针的工作液（浓度分别为10mol/L）。表4 目标基因引物和探针序列及每个反应体系内的终浓度引物和探针名称 序列 终浓度（mol/L）沙门
14、氏菌-F 5-AGC CAA CCA TTG CTA AAT TGG CGC A-3 0.4沙门氏菌-R 5-GGT AGA AAT TCC CAG CGG GTA CTG-3 0.4内部扩增对照（IAC）-F 5-TGT GAA ATA CCG CAC AGA TG-3 0.4内部扩增对照（IAC）-R 5-AGC TGG CGT AAT AGC GAA G-3 0.4沙门氏菌探针 5-FAM-TTTTTCCTCGCTGGCTACCGCTTCA-BHQ-1-3 0.2IAC探针 5-ROX-TAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC-BHQ-2-3 0.27.9.2 PCR检测体
15、系的配制每个样品按照表5的加液量配制25L反应体系。DBS13/00320156表5 目标基因扩增体系配制表试剂名称 加样体积（L）灭菌去离子水 12.110Taq PCR反应缓冲液 2.550mmol/L MgCl2 2.010mmol/L dNTPs 0.5引物工作液 1.0探针工作液 0.55U/LTaq DNA聚合酶 0.151U/L尿嘧啶-N-糖基化酶 0.25200 拷贝/LpUC19质粒DNA 1.0DNA模板 5.0总体积 257.9.3 PCR检测将配制完成的反应管放入实时荧光定量PCR仪中，按照如下步骤设置反应条件：反应步骤一：预变性，37 4 min，95 5 min，1
16、个循环；反应步骤二：扩增和信号收集，95变性5s，60 退火和延伸60s，50个循环，同时收集FAM和ROX的荧光信号。核查反应条件正确后，启动反应程序。7.9.4 结果判读检测样本Ct值小于或等于40时，报告为阳性；Ct值大于40且小于50时，需要重复一次，如果Ct值仍小于50，且曲线有明显的对数增长期，报告为阳性，否则为阴性；样本没有Ct值时，报告为阴性。具体结果判定参照表6。 表6 沙门氏菌结果判读表沙门氏菌FAM 内部扩增对照（IAC）ROX 结果判读阳性 阳性 沙门氏菌阳性阳性 阴性 沙门氏菌阳性阴性 阳性 沙门氏菌阴性阴性 阴性 无效的结果当FAM通道为阳性时，可报告沙门氏菌阳性；
17、当FAM通道为阴性，ROX通道为阳性时，可报告沙门氏菌阴性；当FAM通道和ROX通道均为阴性时，为无效的结果应重做实验。8 报告8.1 筛选阪崎肠杆菌和沙门氏菌阳性的样品，需分别按GB4789.40、GB4789.4进行确证。8.2 报告每100g（mL）样本中检出或者未检出阪崎肠杆菌和沙门氏菌。DBS13/00320157附 录 A（规范性附录）培养基和试剂的配制除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。A.1 缓冲蛋白胨水（BPW）A.1.1 成分蛋白胨 10.0g氯化钠 5.0g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O） 9.0g磷酸二氢钾 1.5g蒸馏水 1000mLpH7.2A.1.2
18、制法加热搅拌至溶解,调节 pH，121高压灭菌 15min。A.2 营养肉汤培养基（NB）A.2.1 成分蛋白胨 10.0g牛肉粉 3.0 g氯化钠 5.0 g蒸馏水 1 000mLpH7.2A.2.2 制法加热搅拌至溶解,调节 pH，121高压灭菌 15min。A.3 125 g/mL溴化乙锭单叠氮溴溶液（EMA）A.3.1 成分溴化乙锭单叠氮溴 125.0mg灭菌超纯水 1 000mLA.3.2 制法将 125mg溴化乙锭单叠氮溴加至1000mL灭菌超纯水中，混匀。A.4 50 mmol/L的MgCl2溶液DBS13/00320158A.4.1 成分MgCl2 4.76g超纯水A.4.2 制法将上述各成分搅拌溶解，定容至1 L，分装，121高压灭菌15 min，备用。
