1、Dezember 2016DEUTSCHE NORM Preisgruppe 7DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.180.10!%_p“2586077www.din.deDIN 10759Untersuchung von Honig Bestimmung der Saccha
2、rase-Aktivitt Verfahren nach SiegenthalerAnalysis of honey Determination of saccharase activity Siegenthaler methodAnalyse du miel Dtermination de lactivit Mthode selon SiegenthalerAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 10759-1:1998-08www.beuth.deGesamtumfang 9 Se
3、itenDDIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL)DIN 10759:2016-12 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich . 4 2 Normative Verweisungen . 4 3 Begriffe 4 4 Kurzbeschreibung des Verfahrens 4 5 Chemikalien . 4 5.1 Allgemeines . 4 5.2 Phosphat-Pufferlsung 4 5.3 Substratls
4、ung 5 5.4 Sistierlsung 5 6 Gerte und Hilfsmittel . 5 7 Probenahme 6 8 Durchfhrung 6 8.1 Probenvorbereitung . 6 8.1.1 Flssiger oder kandierter Honig ohne Verunreinigungen . 6 8.1.2 Flssiger oder kandierter Honig mit Verunreinigungen 6 8.1.3 Wabenhonig . 6 8.2 Herstellung der Probenlsung 6 8.3 Bestimm
5、ung . 6 9 Auswertung 7 9.1 Berechnung 7 9.2 Przision des Verfahrens 7 10 Untersuchungsbericht . 8 Literaturhinweise . 9 DIN 10759:2016-12 3 Vorwort Diese Norm wurde vom Arbeitsausschuss NA 057-05-08 AA Honiguntersuchung“ im DIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL), era
6、rbeitet. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. DIN ist nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Die Werte fr die Wiederholgrenze und die Vergleichgrenze sind aus Ringversuchen gewonnen
7、worden. Sie gelten mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 %. Das bedeutet, dass im Durchschnitt bei 20 Untersuchungen einmal eine berschreitung der angegebenen Werte erwartet werden kann. nderungen Gegenber DIN 10759-1:1998-08 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) der Bezug auf die zurckgezogene No
8、rm DIN 10759-2 wurde entfernt; b) der Abschnitt 2, Normative Verweisungen, wurde angepasst; c) der Abschnitt 7, Probenahme, wurde mit Verweisung auf ein geeignetes Probenahmeverfahren nach DIN 10742 angepasst. Frhere Ausgaben DIN 10759-1: 1998-08 DIN 10759:2016-12 4 1 Anwendungsbereich Diese Norm le
9、gt ein Verfahren zur Bestimmung der Saccharase-Aktivitt (-Glucosidase) in Honig fest. 2 Normative Verweisungen Die folgenden Dokumente, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bez
10、ug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN 10742, Untersuchung von Honig Leitfaden zur Probenahme 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gilt der folgende Begriff. 3.1 Saccharase-Aktivitt (na
11、ch dem Siegenthaler-Verfahren) der nach dem Verfahren nach Siegenthaler ermittelte Abbau des Substrates p-Nitrophenyl-D-glucopyranosid (p-NPG) zum Produkt p-Nitrophenol Anmerkung 1 zum Begriff: Die Berechnung der Saccharase-Aktivitt ergibt den Aktivittswert U in Einheiten je kg Honig. 1 U ist die En
12、zymaktivitt, die eine Substratmenge von 1 mol je min unter festgelegten, fr das jeweilige Enzym optimalen Bedingungen (pH-Wert, Temperatur) umsetzt. 4 Kurzbeschreibung des Verfahrens Bei dem photometrischen Messverfahren werden definierte Volumina an Probenlsung und Substratlsung grndlich vermischt.
13、 Nach einer Inkubationszeit von 20 min bei (40,0 0,2) C wird die Reaktion mittels einer Sistierlsung gestoppt. Die Honiglsung wird erst nach der Zugabe der Sistierlsung in die Blindprobe pipettiert. Die Extinktion wird gegen die Blindprobe gemessen, und daraus wird die Saccharase-Aktivitt in Einheit
14、en je kg Honig errechnet. 5 Chemikalien 5.1 Allgemeines Es sind analysenreine Chemikalien zu verwenden. Das verwendete Wasser muss destilliert oder mindestens von entsprechender Reinheit sein. Unter Lsung ist eine wssrige Lsung zu verstehen. 5.2 Phosphat-Pufferlsung c (KH2PO4) = 0,086 mol/l1), c (Na
15、2HPO4 2 H2O) = 0,014 mol/l1), 1)Stoffmengenkonzentration DIN 10759:2016-12 5 c (KH2PO4+ Na2HPO4 2 H2O) = 0,1 mol/l1), pH = 6,0 Es werden 11,66 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) und 2,56 g Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 2 H2O) in etwa 900 ml Wasser gelst und mit Wasser auf 1 000 ml auf
16、gefllt. 5.3 Substratlsung c (p-NPG) = 0,02 mol/l1), pH = 6,0 In einem 1 000-ml-Messkolben werden 6,025 2 g p-Nitrophenyl-D-glucopyranosid (p-NPG) in Phosphat-Pufferlsung (siehe 5.2) gelst. Da p-NPG schwer wasserlslich ist, kann der zum Lsen verwendete Puffer auf etwa 60 C erwrmt werden. Die Lsung is
17、t danach sofort wieder abzukhlen. Nach dem Abkhlen auf Raumtemperatur wird die Lsung mit der angegebenen Phosphat-Pufferlsung auf 1 000 ml aufgefllt. Die Lsung ist sofort verwendbar. Sie ist bei Lagerung in einer Lichtschutzflasche bei etwa 4 C im Khlschrank nicht lnger als 1 Woche haltbar. 5.4 Sist
18、ierlsung c (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan) = 3 mol/l1), pH = 9,5 In einem 1 000-ml-Messkolben werden 363,42 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan in Wasser gelst. Mit Salzsure, c (HCl) = 3 mol/l1), wird die Lsung auf pH = 9,5 eingestellt und auf 1 000 ml aufgefllt. 6 Gerte und Hilfsmittel bliche Lab
19、oratoriumsgerte und insbesondere die Gerte nach 6.1 bis 6.10: 6.1 Sieb aus nichtrostendem Edelstahl, Maschenweite 0,50 mm. 6.2 Reagenzglasschttler 6.3 Wasserbad mit Thermostat, geeignet zur Einhaltung der Temperatur auf (40,0 0,2) C. 6.4 Spektralphotometer, zur Messung bei 400 nm. 6.5 Stoppuhr (Enzy
20、muhr). 6.6 Pipetten. 6.7 Messkolben, Nennvolumen 25 ml und 1 000 ml. 6.8 Reagenzglser aus Glas, Nennvolumen 10 ml. 6.9 Messkvetten aus Glas oder Kunststoff, Schichtdicke 10 mm. 6.10 Becherglser Die zur Durchfhrung der Bestimmung und zur Aufbewahrung von Reagenzien verwendeten Gerte mssen frei von De
21、tergenzien sein. DIN 10759:2016-12 6 7 Probenahme Die Probenahme ist kein Bestandteil des in diesem Dokument festgelegten Verfahrens. Ein geeignetes Probenahmeverfahren ist in DIN 10742 angegeben. 8 Durchfhrung 8.1 Probenvorbereitung 8.1.1 Flssiger oder kandierter Honig ohne Verunreinigungen Die Lab
22、oratoriumsprobe ist durch intensives Rhren (mindestens 3 min) ausreichend zu homogenisieren. Dabei ist darauf zu achten, dass insbesondere bei Weiterverwendung der Laboratoriumsprobe zur Bestimmung von Hydroxymethylfurfural (HMF) mglichst wenig Luft eingerhrt wird. 8.1.2 Flssiger oder kandierter Hon
23、ig mit Verunreinigungen Nach Entfernung der Verunreinigungen wird der Honig bei Raumtemperatur glattgerhrt und durch ein Sieb nach 6.1 gegeben. Kandierter Honig wird mit einem Spatel durch das Sieb nach 6.1 gerhrt. 8.1.3 Wabenhonig Falls die Waben noch geschlossen sind, werden sie zunchst entdeckelt
24、. Mit Hilfe eines Siebes nach 6.1 wird der Honig ohne Erwrmung vollstndig von den Waben getrennt. 8.2 Herstellung der Probenlsung Es werden 4 g Honig auf 0,01 g abgewogen, in etwa 15 ml Phosphat-Pufferlsung (siehe 5.2) gelst und quantitativ in einen 25-ml-Messkolben bergefhrt. Die Lsung wird danach
25、mit der Phosphat-Pufferlsung bis zur Marke aufgefllt, und der Messkolben wird nach dem Verschlieen krftig geschttelt. Die Probenlsung ist gekhlt etwa 24 h haltbar. 8.3 Bestimmung In ein Reagenzglas werden 5 ml Substratlsung (siehe 5.3) pipettiert. Nach etwa 5 min Vorwrmzeit bei (40,0 0,2) C im Wasse
26、rbad werden 0,5 ml Probenlsung (siehe 8.2) einpipettiert. Der Zeitpunkt des Einpipettierens der Probenlsung ist die Startzeit. Sofort anschlieend wird der Reagenzglasinhalt mittels Reagenzglasschttler hchstens 10 s durchmischt. Das Reagenzglas wird in das Wasserbad bei (40,0 0,2) C zurckgestellt. Na
27、ch 20 min 5 s Inkubationszeit werden 0,5 ml Sistierlsung (siehe 5.4) einpipettiert, und der Reagenzglasinhalt wird erneut mittels Reagenzglasschttler durchmischt. Die Zugabe der stark alkalischen Sistierlsung stoppt die Enzymreaktion. Aus dem Produkt p-Nitrophenol entsteht das p-Nitrophenolat-Anion.
28、 Der Ansatz einer Blindprobe (Leerwert) erfolgt parallel zur Analysenprobe. Fr die Blindprobe werden ebenfalls 5 ml Substratlsung (siehe 5.3) in ein Reagenzglas pipettiert, im Wasserbad bei (40,0 0,2) C vorgewrmt und im Gegensatz zur Analysenprobe ohne Probenlsung (siehe 8.2) 20 min inkubiert. Danac
29、h werden ebenfalls 0,5 ml Sistierlsung (siehe 5.4) einpipettiert, und der Inhalt wird durchmischt. Erst jetzt werden in die Blindprobe 0,5 ml der Probenlsung (siehe 8.2) pipettiert. Der Inhalt wird erneut durchmischt. Nach Ablauf der Inkubation werden die Reagenzglser aus dem Wasserbad genommen. Wen
30、n die Anstze auf Raumtemperatur abgekhlt sind, wird die Extinktion der Analysenprobe gegen die Blindprobe im Spektralphotometer bei 400 nm gemessen. DIN 10759:2016-12 7 9 Auswertung 9.1 Berechnung Die Saccharase-Aktivitt, angegeben als SZ(Siegenthaler)in U/kgHonig, wird nach Gleichung (1) berechnet:
31、 ()=400 f (1) Dabei ist E400die Extinktion der Probenlsung bei 400 nm; Vfder Verdnnungsfaktor, bezogen auf 1 kg Honig (hier Vf= 50 000); V das Volumen der Probenlsung, in Milliliter (hier V = 6 ml); t der Faktor zur Berechnung der Reaktionszeit auf 1 min (hier t = 0,05); K der Faktor fr die molare K
32、onzentration des p-Nitrophenol (hier K = 0,052 98); mEdie Einwaage in Gramm (hier mE= 4,00 g). Hieraus ergibt sich: Z(Siegenthaler)= 400 198,68 (2) Das Ergebnis wird auf eine Stelle nach dem Komma gerundet angegeben. 9.2 Przision des Verfahrens Die in einem Ringversuch nach DIN ISO 5725-1 und DIN IS
33、O 5725-2 ermittelten Przisionsdaten sind in Tabelle 1 wiedergegeben. DIN 10759:2016-12 8 Tabelle 1 Ergebnisse des Ringversuchs Probe r srR sR(alle Angaben in U/kgHonig) Gebirgsbltenhonig 90,36 4,52 1,60 8,95 3,16 Trkischer Pinienhonig 191,89 6,22 2,20 21,30 7,53 Rumnischer Bltenhonig 51,63 2,27 0,80
34、 4,87 1,72 Akazien- und Sommertracht-honig 24,77 1,76 0,62 3,76 1,33 Wald-Tannenhonig 142,94 4,15 1,47 14,32 5,06 Gesamtmittelwert r Wiederholgrenze srWiederholstandardabweichung R Vergleichgrenze sRVergleichstandardabweichung 10 Untersuchungsbericht Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf di
35、ese Norm anzugeben: a) Art, Herkunft und Bezeichnung der Probe; b) eine Verweisung auf diese Norm oder das verwendete Verfahren; c) Art und Datum der Probenahme; d) Eingangs- und Untersuchungsdatum; e) Saccharase-Aktivitt, angegeben als Saccharasezahl nach Siegenthaler, SZ(Siegenthaler), in U/kgHoni
36、g(DIN 10759-1), gerundet auf eine Stelle nach dem Komma; f) Begrndung, falls von dieser Norm abgewichen worden ist. DIN 10759:2016-12 9 Literaturhinweise DIN ISO 5725-1, Genauigkeit (Richtigkeit und Przision) von Messverfahren und Messergebnissen Teil 1: Allgemeine Grundlagen und Begriffe DIN ISO 57
37、25-2, Genauigkeit (Richtigkeit und Przision) von Messverfahren und Messergebnissen Teil 2: Grundlegende Methode fr Ermittlung der Wiederhol- und Vergleichprzision eines vereinheitlichten Messverfahrens SIEGENTHALER, U.: Eine einfache und rasche Methode zur Bestimmung der -Glucosidase (Saccharase) im Honig. In: Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg., Band 68 (1977), S. 251-258.
