GB 15193.10-1994 非程序性DNA合成试验.pdf

1、中华人民共和国国家报准GB 15193 1 0 94 非程序性。NA合成试验Unscheduled DNA synthesis test 1 3:题内容与适用范倒牛二、标准魏定了非程序性DNA合成试验的基本技术要求e；本标准适用于预测环境有害物质的致癌性诱变性，用这种短期筛选方法可以检测出一些短期体外试验讼所不能检出的诱变剂致癌剂。2 号！想草草准GB 15193. 4 鼠伤寒沙门氏茵哺乳动物微粒体酶试验3底想iE常情况下，于细熄有丝分裂周期中，仅S期是DNA合成颊。当DNA受损伤肘，损伤穆复约DNA合成交要在其他细赖周期，称程序外DNA合成，郎DS，因此发罪恶UDS增寓，llP漠明DNA发生

2、过损伤。在体外培养细胞中，用UDS的测量来显示DNA修复合成的:E要关键在于如何鉴别很高水平的半保留DNA复制和水平较低充其量只有半保留DNA复制的5%）的UDS.这可以用同步培养将细跑跑墩子G，草草并用药物常用装基摞掷秘残留的半保留。何A复制后虽是示。同步培养Till缺乏必需靠在签酸精氨酸的培养基ADMJ使DNA合成的始动受阻而使细胞同步于G，期。在这些半保留日NA合成明显抑制和阻断了的细胞中，UDS即可用咀胸腺11!晓核苦的掺入增加显示。它可Ill放射自显露苦或液体闪烁计数法进行测量去3 试剂的配ljjlj幸自级JlllJ培养器血的准备3. 1 试剂余部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为

3、双蒸水。3. 1. 1 缀5量增殖用培养基二EagletI:;般读要求培养蒸（MinimalEssential Medium，曹雪称EMEM鸿5份，小牛血清15份，如入青霉素、链霉素贮存液1份，使青霉素、链霉素的最终浓度分裂为100单位及100附ml EMEM 培养基可选用各种商品供应之粉末培养基按生产厂商提供资料配制并除酶。4冰箱贮存。3. 1.2阔步Jll培养怒2不含精氨酸之立agle沃MEM培养基（ADMJ98份，小牛血清2份，青霉素、链霉素浓度向绍施增殖烧培养基e3. 1 3 Hanks平衡她溶液（HESS)贮液A将氯化纳160g，氯化御8g，硫酸镇（MgSO, 7H,0)2日及氯化镣

4、（MgC2 6H20)2日溶于800 mL双蒸水（5060中。另取无水氯化钙2.8 g溶于100n1l，双蒸水中。将上述两溶液混合后，加水至1000 ml，放入三氯Ejlj烧zmL，保存于4帘。中华人民共和国卫生k部1994-08-10批准1994 08-10实施571 GB 15193 1 0 94 贮液B将磷酸氢二纳（Na,HP04 12H,() 3. 04 g （或Na,HPO, 2H,Ol. 2 g ）、磷酸二氢御(KH,PO, 2H,0) 1. 2 g （或KH2PO,o.95 g）、葡萄糖20g溶解于800mL双蒸水中，加入100mLO. 4% 勘红溶液（取盼红1g，溶于3ml,!

5、 mol/L氢氧化锅中，待完全溶解后，加入双蒸水中至250ml，），加水至1ooo mL,lJO入三氯甲烧2mL，保存于4中。贮液c:. 4%碳酸氢销以双蒸水配制。应用液的配和jz取A液1份，B液1份，水18份，混合后分装于玻璃容器内，高压灭菌，4保存。用前加入1.4%碳酸氢锅，将pH调整至7.2 7. 4。3. 1. 4 磷酸缓冲液（无钙、簇的Dulbecco氏磷酸缓冲盐液）（pH7.4)取氯化销s.00 g、磷酸二氢梆o.20 g、氯化梆0.20目、磷酸氢三销（Na,HP04 12H,0)2. 89日溶于1 000 mL双蒸水中。3. 1. 5 o. 02 %乙二胶四乙酸二销或四销（EDT

6、A）溶液。取EDTAO.2 g溶于无钙、镇之磷酸缓冲液中，使成1000 mL0高压灭商后使用。3. 1-6抗菌素贮存液取临床注射用青霉素G100万单位及链霉素1g之粉针，在无茵操作下溶于lOOmL之灭菌蒸缩水中，使青霉素及链霉素在溶液中之浓度分别为1万单位及10000吨mL，使用时每100mL培养基中加入抗菌素贮存液1mLo 3. 1. 7 大鼠肝微粒体s9组分的制备：按GB15193. 4执行。S-9混合液可按以下方式配制z将磷酸氢二纳（Na,HP04 lZH,0)86. 8 mg，磷酸二氢惆7.0 mg、氯化续（MgCI, 6H,0)8. 1 mg,6磷酸葡萄糖（G-6-P)5.4 mg，

7、辅酶E(Co i ）（纯度90%)4mg溶于ADM中，加入1mol/LN-2瓷乙基吸嗦N-2乙磺酸（HEPES）溶液o.2 mL及大鼠肝sg组分0.84mL或20 mL，并用碳酸氢锅溶液调整pH至7.27.4。3. 1.a 显影液及定影液（放射自显影用）3.1.a.1 KodakD-170显影液贮液z无水亚硫酸纳25g、澳化梆1g，水加至200mLo使用时用水稀释至1000 ml，溶入Amitol(2氨基酸盐酸盐）4.5 g 0 3. 1- 8. 2 Kodak D-196显影液水（50）500mL，顺次溶入米吐尔（硫酸对甲氨基苯盼）2g，无水亚硫酸锅72g ，对苯二盼8.8 g，无水碳酸纳4

8、8g ，澳化饵4g，加水至全量1000 mLo 3. 1-8-3停显液98%冰乙酸15mL, :!Jo水至1ooo mLo 3. 1 8. 4 Kodak F 5定影液水（50）100mL，依次溶入海波240g，无水亚硫酸销15g,28%乙酸48mL，棚酸（结晶）7.5 g，何矶15g，加水至1000 mL。3. 1- 9 O. 25 mol/L及O.5 mot凡高氯酸：70%高氯酸（售品）8.57 mL，如水至100mL为1mol/L。3. 1. 10 闪烁液2称取2,5二苯基螺胆量（PP0)5g、1,4双5苯基唔瞠基2苯（POPOP)300mg溶于甲苯中，使成1000 mLo 应用一次性细

9、胞培养用器皿及微孔滤膜，可避免繁琐的洗涤工作，并可提高实验质量。玻璃类z在自来水中将污物冲净，在肥皂或洗衣粉溶液中煮沸5min，稍冷后在热肥皂水内反复洗刷，用自来水冲洗干净。干后浸于清洁液内过夜。取出后用自来水反复件洗12次。再用蒸锢水冲洗2次，于蒸缩水浸泡24h。取出后用蒸馆水再冲洗2次，烘干。所用玻瓶用纸包扎瓶口，移液管及漓管在近端管内塞入棉花栓后用纸包囊。橡皮类：自来水中冲洗干净后，在肥皂水内煮沸。若为新购置的，则用4%氢氧化纳煮沸10min，再用4%盐酸煮沸10mino自来水流水冲洗2h以上。再于蒸馆水中煮沸2次，用蒸馆水冲洗后，浸泡于蒸572 GB15193.1Q94 馆水中24h，

10、干燥后，用玻璃纸包装。置于容器内。6号玻璃滤器（除菌用新购置的浸入含少量亚硝酸铀的热硫酸内24h，蒸锢水抽滤后，用氢氧化销溶液抽滤至中性，再用双蒸水抽滤2次，烘干后配上橡皮塞后包扎。滤器使用后立即用蒸馆水抽滤次，随后用1%亚硝酸锅硫酸溶液（硫酸溶液浓度。.5 mol/L）抽滤后，浸于该硫酸溶液内（注意必须使滤板的两侧都浸于酸内）。清水冲洗后，用蒸馆水抽滤3次，干燥后，配塞包扎。灭菌z对不带橡皮塞的玻具及金属用具可用干热灭菌，温度升至140后，保持2h0橡皮类及带橡皮塞之玻具应用高压灭菌12030mino溶液除不耐热的应用抽滤除菌外，耐热的可用高压灭菌，一般用11510mino 4 步骤4. 1

11、 细胞的传代、维持和贮存用于化学致癌物在体外培养细胞中诱发UDS的实验研究的哺乳类细胞的种类很多。人类细胞的UDS反应大于峭齿类细胞。在化学致癌性检测试验中很多人使用人类细胞。这有一个可取的优点，即某一化学物质对人类危害作评价时，可减轻因种属差异而导致推论错误的风险使用最多的人类细胞为成纤维细胞，外周血淋巴细胞，单核细胞和Hela细胞等。使用人羊膜细胞FL株，是一种上皮细胞系，且该羊膜细胞富含有可诱导的药物代谢酶系。生长成单层的细胞，除去培养基。用Hanks平衡盐液（HBSS）洗涤后，用0.02%EDTA或o.1 %膜酶溶液（于无Ca+,Mg之磷酸缓冲液中）于37下处理数分钟使细胞退缩，细胞间

12、间隙增加。再用HBSS洗涤1次，加入适量培养基，反复吹吸，使细胞自玻面上脱下并分散于培养基中。取细胞悬液滴，加于血球汁数池中，计数四大格中的细胞数，计算出悬液中之细胞浓度（四大格的细胞数41O即为每毫升所含细胞数。将细胞悬液用生饮用培养基稀释至o.5110个mLo将上述细胞悬液接种于培养瓶中（30mL培养瓶可接种3mL0 100 mL的可接种10mL）。每次接种3份，妖成融合单层后取其中一瓶再按以上方法传代接种3瓶。另两瓶在证明传代成功后弃去或供实验所用，这样可保证细胞在实验中延续保持。有条件可按下法将细胞贮存于液氮中。若较长时间不用，不必在实验室中维持。在需要时取出经增殖后供实验所用。将细胞

13、增殖至所需数量后，按上法制成细胞悬液（于生长用培养基中），细胞浓度为11.5 x 10个mL。在冰浴中，逐滴加入为细胞悬液总量10%的灭菌二甲亚哥乱，然后将细胞悬液分装于洁净干燥之灭菌安部或细胞冻存专用塑料小管中，每份1mL。封口后，置于4中23h. 然后移至普通冰箱之冰格内45h，再移入一3020C之低温冰箱内过夜。次日展将安蘸移入生物用液氮贮存器内。需用时，将安部或小管臼液氮中取出，投入37之水浴内使其迅速解冻。离心(2 000 r/min）后将安瓶或小管锯打开，除去含有二甲亚飘的培养基，加入适量之生饮用培养基，并调整细胞浓度至101510个mL。分种于细胞培养瓶中，37C培养1d后，换培

14、养基一次，将无活力之细胞除去，待长成融合单层后分传增殖维持于实验室中。4. 2 UDS的放射自显影显示法将细胞增殖至所需数量后，按上述方法制成单细胞悬液，细胞悬于生长用培养基（EMEM85小牛血清15）中。浓度为o.5 lX 105个mL。将上述细胞悬液接种于置有小盖片（18mm 6 mm）之培养瓶中，37培养13d，使细胞在盖片上生长至适当密度培养瓶接种数目根据检品的数目、所选剂量级别而定。每一剂量作23个样片，并另备46个样本供溶剂对照和己知致癌物的阳性对照用。细胞在增殖培养后，按以同步培养周培养基（ADM补以1%小牛血清作同步培养34d。在实验前一日下午，加入溶于ADM之程基腺（HU）溶

15、液，使HU在培养基中之终浓度为10mmol/L。继续在37下孵育16h，然后将上述长有细胞之盖片置于含有不同浓度之检品、HU（浓度为10mmol/L）及H胸腺略晓核昔(5 10 Ci/mL,30 Ci/mmol）之同步用培养基中。37中孵育5ho以溶剂及已知致癌物为对照。检品及已知致癌物溶液在实验时新鲜配制。先将它们溶于适当之溶剂（蒸铺水、二甲亚枫、丙阔等中，配成最高测试浓度100倍的贮液。再依次以溶剂按10倍稀释，作成不同浓度之检品溶液。将各种浓;7:1 GB 15193. 10-94 度的检品溶液，加于培养基中，使溶剂的最终浓度为1%。孵育结束后，用HBSS充分洗涤，用1%拧核酸销溶液处理

16、10min，随后用乙醇冰乙酸（3 1）固定(4）过夜，空气中干燥后，用少量中性树胶，将盖片粘固于载玻片上，长有细胞的一面朝上，45烘烤24 h0 在暗室中，将适量之核4乳胶移入浸渍用之玻璃器皿中，置于40之水浴中令其融化，同时取等量之蒸饱水于一量筒中也置于该水浴中加热，待乳胶融化后，将热蒸馆水倾于乳胶液中，继续在水浴中加温，并用玻璃棒轻轻搅拌，等待1020min，使气泡逸出。在以上准备过程中，将准备作自显影处理之玻片置于水浴之平台上预热。准备就绪后，将玻片垂直浸渍于1 1稀释之乳胶液中约5s，徐徐提出玻片，并将玻片背面之乳胶用纱布或擦镜纸拭去。将已涂有乳胶之玻片移入温度为29及一定湿度之温箱中

17、(4 h）待乳胶干澜。然后置于内置适量干燥剂（变色硅胶）袋之曝光盒中。曝光盒外包以黑色避光纸及塑料纸，置于4冰箱中曝光10d。曝光结束后，将玻片移入有机玻璃制成的玻片架上，在液温为19之D 170或D196显影液中显影5min，在停显液中漂洗2min，在F-5定影液中定影610min再用水漂洗数小时。细胞可在乳胶涂片前用地衣红（2%）冰乙酸溶液或在显影后用H.E或Giemsa染液染色。将玻片脱水透明后，用盖片封固。在泊渍镜下，计数各样本细胞核上之显影银粒数，同时计数相当面积之本底银粒数，并自核上之银粒数减去。计数3050个细胞核，计出对照样本、各种浓度检品处理的样本及阳性致癌物对照样本中银粒数

18、核的均值及其统计量。4. 3 UDS的液体闪烁计数显示法将实验用细胞悬于生长用培养基中，细胞浓度为o.5105个mL，将细胞接种于液体闪烁计数瓶中，每瓶1mL，并加入14C胸腺略院核苦终浓度为Q.01 Ci/mL(50 mCi/mmol）。37中培养48h使细胞增殖并预标记，去培养基并用HBSS洗涤后，换以含C胸腺嘻晓核背（0.01 Ci/mL）之同步用培养基，在37中进行同步培养24d，同步培养结束后，于实验前一日下午去培养基，用HBSS充分洗涤后，加入含有浓度为10mmol/L辉基腺（HU）之同步用培养基，37中孵育16h,UDS的诱发同放射自显影显示法。细胞在含有HU及咀胸腺嘻晓核背（5

19、Ci/mL,30 Ci/mmol）之同步用培养基中与不同浓度之检品接触5h，孵育结束后，去培养基及检品。以冷盐水洗涤2次，随后用冰冷之0.25 mol/l，过氯酸溶液处理2次，每次2min，以固定细胞并除去酸可溶性成分，再用乙醇处理10min以除去脂溶性成分及未掺入之标记物，干后以o.5 1 mol/L过氯酸o.5 mL于7580之恒温箱中水解40min，使掺入之标记物释出。冷却后加入乙二醇乙酷3.5 mL及闪烁液（PPOO.5%、POPOPo. 03%，以甲苯为溶剂）5mL，振摇后使呈匀相，以液体闪烁计数器测定各样本中之C及H的放射活性。标本中的H放射活性即反映UDS中H胸腺略晓核昔的掺入量

20、；而“C的放射活性反映实验细胞的数目或其DNA量，因此泪和14C放射活性之比（H/C）即为单位质量DNA或单位数目细胞中之UDS水平的反映值。若将溶剂对照的H和14C比值作为100%(1. 00），可计算出各个样本中对于对照变化量，并计算各种检品测试浓度的样本中的有关统计量。4.4 受试物的代谢活性建株细胞中药物代谢活化酶系的活性一般都很低，因此对一些需经酶性代谢活化才显示其DNA损伤作用的化学物质，可在试验体系中加入以大鼠肝微粒体酶系及辅助因子组成的体外活化系统（S9 混合液），在检品接触时所用的培养基中，另溶入或加入氯化镇（MgCl, 6H,O）、磷酸氢二锅、磷酸二氢仰、6磷酸葡萄糖（G-

21、6P）、NADP(Coll）及大鼠肝S-9组分，使每毫升中分别含有Mg、p（），、GP及Con 3、20、1及o.8 mol及4%ZO%S-9组分，S-9组分所占比例视检品的亲脂性而变；亲脂性强的可用低百分数的s9反之，则所用S-9组分在活化系中之比例可高些。并加入HEPES(lOmol/ml，），以NaHCO，溶液将pH调至7.2 7. 4。574 GB 15193.10 94 4.5 结果判断可用Student氏“f测验检验各检品接触与溶剂对照间有无显著性差异而作出判断。附加说明：本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由浙江医科大学负责起草。本标准主要起草人余应年、了辰。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。575