GB 15193.10-1994 非程序性DNA合成试验.pdf
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1、中华人民共和国国家报准GB 15193 1 0 94 非程序性。NA合成试验Unscheduled DNA synthesis test 1 3:题内容与适用范倒牛二、标准魏定了非程序性DNA合成试验的基本技术要求e;本标准适用于预测环境有害物质的致癌性诱变性,用这种短期筛选方法可以检测出一些短期体外试验讼所不能检出的诱变剂致癌剂。2 号!想草草准GB 15193. 4 鼠伤寒沙门氏茵哺乳动物微粒体酶试验3底想iE常情况下,于细熄有丝分裂周期中,仅S期是DNA合成颊。当DNA受损伤肘,损伤穆复约DNA合成交要在其他细赖周期,称程序外DNA合成,郎DS,因此发罪恶UDS增寓,llP漠明DNA发生
2、过损伤。在体外培养细胞中,用UDS的测量来显示DNA修复合成的:E要关键在于如何鉴别很高水平的半保留DNA复制和水平较低充其量只有半保留DNA复制的5%)的UDS.这可以用同步培养将细跑跑墩子G,草草并用药物常用装基摞掷秘残留的半保留。何A复制后虽是示。同步培养Till缺乏必需靠在签酸精氨酸的培养基ADMJ使DNA合成的始动受阻而使细胞同步于G,期。在这些半保留日NA合成明显抑制和阻断了的细胞中,UDS即可用咀胸腺11!晓核苦的掺入增加显示。它可Ill放射自显露苦或液体闪烁计数法进行测量去3 试剂的配ljjlj幸自级JlllJ培养器血的准备3. 1 试剂余部试剂除注明外,均为分析纯,试验用水为
3、双蒸水。3. 1. 1 缀5量增殖用培养基二EagletI:;般读要求培养蒸(MinimalEssential Medium,曹雪称EMEM鸿5份,小牛血清15份,如入青霉素、链霉素贮存液1份,使青霉素、链霉素的最终浓度分裂为100单位及100附ml EMEM 培养基可选用各种商品供应之粉末培养基按生产厂商提供资料配制并除酶。4冰箱贮存。3. 1.2阔步Jll培养怒2不含精氨酸之立agle沃MEM培养基(ADMJ98份,小牛血清2份,青霉素、链霉素浓度向绍施增殖烧培养基e3. 1 3 Hanks平衡她溶液(HESS)贮液A将氯化纳160g,氯化御8g,硫酸镇(MgSO, 7H,0)2日及氯化镣
4、(MgC2 6H20)2日溶于800 mL双蒸水(5060中。另取无水氯化钙2.8 g溶于100n1l,双蒸水中。将上述两溶液混合后,加水至1000 ml,放入三氯Ejlj烧zmL,保存于4帘。中华人民共和国卫生k部1994-08-10批准1994 08-10实施571 GB 15193 1 0 94 贮液B将磷酸氢二纳(Na,HP04 12H,() 3. 04 g (或Na,HPO, 2H,Ol. 2 g )、磷酸二氢御(KH,PO, 2H,0) 1. 2 g (或KH2PO,o.95 g)、葡萄糖20g溶解于800mL双蒸水中,加入100mLO. 4% 勘红溶液(取盼红1g,溶于3ml,!
5、 mol/L氢氧化锅中,待完全溶解后,加入双蒸水中至250ml,),加水至1ooo mL,lJO入三氯甲烧2mL,保存于4中。贮液c:. 4%碳酸氢销以双蒸水配制。应用液的配和jz取A液1份,B液1份,水18份,混合后分装于玻璃容器内,高压灭菌,4保存。用前加入1.4%碳酸氢锅,将pH调整至7.2 7. 4。3. 1. 4 磷酸缓冲液(无钙、簇的Dulbecco氏磷酸缓冲盐液)(pH7.4)取氯化销s.00 g、磷酸二氢梆o.20 g、氯化梆0.20目、磷酸氢三销(Na,HP04 12H,0)2. 89日溶于1 000 mL双蒸水中。3. 1. 5 o. 02 %乙二胶四乙酸二销或四销(EDT
6、A)溶液。取EDTAO.2 g溶于无钙、镇之磷酸缓冲液中,使成1000 mL0高压灭商后使用。3. 1-6抗菌素贮存液取临床注射用青霉素G100万单位及链霉素1g之粉针,在无茵操作下溶于lOOmL之灭菌蒸缩水中,使青霉素及链霉素在溶液中之浓度分别为1万单位及10000吨mL,使用时每100mL培养基中加入抗菌素贮存液1mLo 3. 1. 7 大鼠肝微粒体s9组分的制备:按GB15193. 4执行。S-9混合液可按以下方式配制z将磷酸氢二纳(Na,HP04 lZH,0)86. 8 mg,磷酸二氢惆7.0 mg、氯化续(MgCI, 6H,0)8. 1 mg,6磷酸葡萄糖(G-6-P)5.4 mg,
7、辅酶E(Co i )(纯度90%)4mg溶于ADM中,加入1mol/LN-2瓷乙基吸嗦N-2乙磺酸(HEPES)溶液o.2 mL及大鼠肝sg组分0.84mL或20 mL,并用碳酸氢锅溶液调整pH至7.27.4。3. 1.a 显影液及定影液(放射自显影用)3.1.a.1 KodakD-170显影液贮液z无水亚硫酸纳25g、澳化梆1g,水加至200mLo使用时用水稀释至1000 ml,溶入Amitol(2氨基酸盐酸盐)4.5 g 0 3. 1- 8. 2 Kodak D-196显影液水(50)500mL,顺次溶入米吐尔(硫酸对甲氨基苯盼)2g,无水亚硫酸锅72g ,对苯二盼8.8 g,无水碳酸纳4
8、8g ,澳化饵4g,加水至全量1000 mLo 3. 1-8-3停显液98%冰乙酸15mL, :!Jo水至1ooo mLo 3. 1 8. 4 Kodak F 5定影液水(50)100mL,依次溶入海波240g,无水亚硫酸销15g,28%乙酸48mL,棚酸(结晶)7.5 g,何矶15g,加水至1000 mL。3. 1- 9 O. 25 mol/L及O.5 mot凡高氯酸:70%高氯酸(售品)8.57 mL,如水至100mL为1mol/L。3. 1. 10 闪烁液2称取2,5二苯基螺胆量(PP0)5g、1,4双5苯基唔瞠基2苯(POPOP)300mg溶于甲苯中,使成1000 mLo 应用一次性细
9、胞培养用器皿及微孔滤膜,可避免繁琐的洗涤工作,并可提高实验质量。玻璃类z在自来水中将污物冲净,在肥皂或洗衣粉溶液中煮沸5min,稍冷后在热肥皂水内反复洗刷,用自来水冲洗干净。干后浸于清洁液内过夜。取出后用自来水反复件洗12次。再用蒸锢水冲洗2次,于蒸缩水浸泡24h。取出后用蒸馆水再冲洗2次,烘干。所用玻瓶用纸包扎瓶口,移液管及漓管在近端管内塞入棉花栓后用纸包囊。橡皮类:自来水中冲洗干净后,在肥皂水内煮沸。若为新购置的,则用4%氢氧化纳煮沸10min,再用4%盐酸煮沸10mino自来水流水冲洗2h以上。再于蒸馆水中煮沸2次,用蒸馆水冲洗后,浸泡于蒸572 GB15193.1Q94 馆水中24h,
10、干燥后,用玻璃纸包装。置于容器内。6号玻璃滤器(除菌用新购置的浸入含少量亚硝酸铀的热硫酸内24h,蒸锢水抽滤后,用氢氧化销溶液抽滤至中性,再用双蒸水抽滤2次,烘干后配上橡皮塞后包扎。滤器使用后立即用蒸馆水抽滤次,随后用1%亚硝酸锅硫酸溶液(硫酸溶液浓度。.5 mol/L)抽滤后,浸于该硫酸溶液内(注意必须使滤板的两侧都浸于酸内)。清水冲洗后,用蒸馆水抽滤3次,干燥后,配塞包扎。灭菌z对不带橡皮塞的玻具及金属用具可用干热灭菌,温度升至140后,保持2h0橡皮类及带橡皮塞之玻具应用高压灭菌12030mino溶液除不耐热的应用抽滤除菌外,耐热的可用高压灭菌,一般用11510mino 4 步骤4. 1
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- GB 15193.10 1994 程序性 DNA 合成 试验
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