GBZ T 240.12-2011 化学品毒理学评价程序和试验方法 第12部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验.pdf

1、ICS 13. 100 C 52 , 中华人民共和国国家职业卫生标准GBZ/T 240.12-2011 化学晶毒理学评价程序和试验方法第12部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals一Part 12: In vivo mammalian bone marrow chromosome aberration test 2011-08-19发布2012-03-01实施中华人民共和国卫生部发布数码防伪目lJJ=t 根据中华人民共和国职业病防治法制定本部分。GBZ/T 240(化学

2、品毒理学评价程序和试验方法现分为以下四十四部分:一一第1部分:总则;第2部分:急性经口毒性试验;一一第3部分:急性经皮毒性试验;一一第4部分:急性吸入毒性试验;第5部分:急性眼剌激性/腐蚀性试验;一一第6部分:急性皮肤刺激性/腐蚀性试验;一一第7部分:皮肤致敏试验;第8部分:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验;一一第9部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验;一一第10部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验;一一第11部分:体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验;第12部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验;一一第13部分:哺乳动物精原细胞/初级精母细胞染色体畸变试验;一一第14部分:啃齿类动物显性致死试验;

3、一一第15部分:亚急性经口毒性试验;一一一第16部分:亚急性经皮毒性试验;一一第17部分z亚急性吸人毒性试验;第18部分t亚慢性经口毒性试验;一一第19部分:亚慢性经皮毒性试验;一一第20部分:亚慢性吸入毒性试验;一一第21部分:致畸试验;一一第22部分:两代繁殖毒性试验;一一第23部分:迟发性神经毒性试验;一一第24部分:慢性经口毒性试验;一一第25部分z慢性经皮毒性试验;第26部分:慢性吸人毒性试验;第27部分:致癌试验;一一第28部分:慢性毒性/致癌性联合试验;一第29部分:毒物代谢动力学试验;第30部分:皮肤变态反应试验-局部淋巴结法;一一第31部分:大肠杆菌回复突变试验;-一第32部

4、分z酵母菌基因突变试验;一一第33部分z果蝇伴性隐性致死试验;一一第34部分:枯草杆菌基因重组试验;一一第35部分:体外哺乳动物细胞程序外DNA合成(UDS)试验;一一第36部分:体内哺乳动物外周血细胞微核试验;GBZ/T 240.12-2011 I GBZ/T 240.12-2011 E 第37部分:体外哺乳动物姊妹染色单体交换试验;一一第38部分z体内哺乳动物骨髓细胞姊妹染色体交换试验;一一第39部分:精子畸形试验;第40部分:繁殖/生长发育毒性筛选试验;-一第41部分:亚急性毒性合并繁殖/发育毒性筛选试验;一一第42部分z一代繁殖试验;二一第43部分z神经毒性筛选组合试验;第44部分:免

5、疫毒性试验。本部分为GBZ/T240的第12部分。本部分由卫生部职业卫生标准专业委员会提出。本部分由中华人民共和国卫生部批准。本部分起草单位:湖南省劳动卫生职业病防治所、中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本部分主要起草人:陆丹、孙金秀、常兵、林铮。GBZ/T 240.12-2011 化学晶毒理学评价程序和试验方法第12部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验1 范围GBZ/T 240的本部分规定了体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验的目的、试验概述、试验方法、数据处理与结果评价、评价报告和结果解释。本部分适用于检测化学品对骨髓细胞的遗传毒性。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必

6、不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBZ/T 224 职业卫生名词术语GBZ/T 240. 1 化学品毒理学评价程序和试验方法第1部分:总则3 术语和定义GBZ/T 240.1界定的术语和定义适用于本文件。3. 1 染色单体型畸变chromatid-type aberration 染色单体断裂或染色单体断裂重组的结构损伤。3.2 染色体型畸变chromosome-type aberration 为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组改变的结构损伤。3.3 核内复制endoreduplicat

7、ion 在DNA复制的S期之后，细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个S期的过程。其结果是染色体有4，8，16，倍的染色质。3.4 3.5 3.6 裂隐gap 染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的最小的错误排列。染色体数目畸变chromosomal numerical aberration 染色体数目发生改变，不同于正常核型。多倍体polyploidy 哺乳动物染色体数目正常是二倍体，在化学诱变剂的作用下，染色体数目成倍地增加成三倍体、四GBZ/T 240.12-2011 倍体等。3. 7 染色体结构的畸变chromosomal structure aberration

8、通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体的结构变化。如染色体中间缺失和断片，染色体互换和内交换等。4 试验目的本试验是一项致突变试验，用来检测整体动物骨髓细胞染色体畸变，以评价受试样品致突变的可能性。5 试验概述动物通过适当的途径接触受试样品，一定时间后处死动物。动物处死前，用细胞分裂中期阻断剂处理，处死后取出骨髓，经低渗、固定后制备骨髓细胞染色体标本，经染色，在显微镜下观察中期分裂相细胞，分析细胞染色体畸变。6 试验方法6. 1 试剂6. 1. 1 O. 1 %秋水仙素:置于棕色瓶中，冰箱保存。6. 1. 2 0.9 %氧化铀溶液。6.1.3 0.075 mol/L氯化饵溶液

9、。6. 1. 4 固定液:甲醇与冰醋酸以3: 1 混合，临用时现配。6. 1. 5 姬姆萨(GiemS)染波:Giemsa染料甲醇甘油3.8 g 375 mL 125 mL 配制:将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至315mL，待完全溶解后，再加入125mL甘油，混合均匀。置37oc恒温箱中保温48h。保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。取出过滤，两周后使用。6. 1.6 磷酸缓盐冲液(pH7.4): 1/15 mol/L磷酸氢二锅溶液:磷酸氢二铀(Na2HP04)9.47 g溶于1000 mL蒸悟水中。1/15 mol/L磷酸二氢饵溶液:磷酸二氢饵(KH2P04)49

10、.07 g溶于1000 mL蒸锢水中。取1/15mol/L磷酸氢二锅溶液80mL与1/15mol/ L磷酸二氢饵溶液20mL混合。6. 1. 7 Giemsa应用液:取1份Giemsa染液与9份1/15mol/L磷酸缓盐冲液混合而成。临用时配制。全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为蒸懵水。6.2 受试样晶处理受试样品一般应新鲜配制。如果有资料证明以溶液贮存稳定，可以不必新鲜配制。固体受试样品应溶于或悬于适当的溶剂或载体中，并进行稀释。液体受试样品可直接使用或稀释后使用。根据受试 GBZ/T 240.12-2011 样品的理化性质(水溶性/脂溶性)确定受试样品所用的溶剂或载体。但所用溶剂或载

11、体在使用剂量水平对实验动物应不产生毒作用，且不与受试样品发生任何化学反应。通常用蒸锢水、等渗盐水、植物油、食用淀粉、竣甲基纤维素销等。如非常用的溶剂或载体，应有参考资料说明其成分及选做溶剂的原因。6.3 对照6.3.1 每次试验每一性别都应设置相应的阳性和阴性对照(溶剂/载体)，除不使用受试样品外，其他处理与受试样品组一致。6.3.2 阳性对照组动物体内应能形成可被检测的高于背景的骨髓细胞染色体结构畸变。阳性对照组剂量设置应使致染色体畸变效应明显，但以不能使看片者一看即知编码玻片底细。可只取一个采样点来证明阳性对照。最好使用与受试样品化学分类相关的阳性对照化合物。常用的阳性对照物有:一一甲磺酸

12、乙醋(ethylmethan巳sulphonate，CAS号62-50-0); 一一乙基亚硝基腮(ethylnitrosourea, CAS号759-73-9); +丝裂霉素C(rnitornycinC，CAS号50-07-7); 环磷酷胶(cyc1ophospharnide，CAS号50-8-0); 一一单水环磷酷胶(cyclophospharnidernonohydrate , CAS号6055-19-2); 一一三亚乙基唔胶(triethylen巳m巳larnine，CAS号51-18-3)。6.3.3 阴性对照由溶剂或载体组成。是否在每个采样时间点均设置阴性对照，可依据动物间的变异和历

13、史对照资料中的细胞染色体畸变频率判断。如果采用一个采样时间点作阴性对照，最适采样时间点是第一采样时间点。另外，如果没有历史对照资料证明所用溶剂或载体无诱导缺失或突变效应，还应设空白对照。6.4 实验动物和饲养环境6.4. 1 实验动物:大鼠、小鼠和中国仓鼠是骨髓细胞染色体畸变试验常规使用动物，其他合适的哺乳动物也可选用。应使用健康年轻的成熟动物，如使用小鼠，周龄7周12周为最好。试验初始，动物体重变化应尽量小，即不能超过雌雄动物平均体重的20%。动物应随机分组，每个处理组和对照组每性别都应有至少5只能用于分析的动物。如试验设有几个采样时间点，则要求每组每性别每个采样时间点都有5只能用于分析的动

14、物。如果有资料证明两性别间毒性作用无差别，则可只用一种性别的动物做试验。对人群暴露有性别差异的化学物质，如某些药剂，则要用相应性别的动物做试验。动物购回后应适应实验室新环境至少3d5 do 6.4.2 实验动物和动物实验的环境设施应符合国家相应规定，应有合理的动物管理措施并严格控制环境条件，尽量减少人员流动。饲养条件、疾病、药物治疗、饲料的杂质、空气、饮水、垫料等都可能对试验结果产生巨大影响。6.5 剂量水平6.5. 1 应进行预试验以选择高剂量，为避免出现假阴性结果应适当增大剂量范围。如果受试样品具有毒性，应在第一个采样时间点在最大毒性至最小毒性或无毒性的范围内设三个剂量。第二次采样时间点仅

15、需设置高剂量。高剂量是能使动物出现严重中毒反应的剂量。而有特异生物学活性的物质，在低或元毒剂量(如激素和丝裂摞)可采用其他剂量设置标准。高剂量也可为能在骨髓中产生明显毒性的剂量(如抑制骨髓细胞有丝分裂指数达50%以上)。按等比级数2向下设置中、低剂量组。6.5.2 如剂量水平大于或等于2000 rng/kg体重，24h内进行一次或两次染毒，不产生可观察到的毒性效应，并且根据结构相关物质的资料不能推断受试样品有遗传毒性，则不必设三个剂量。如染毒14d 则高剂量选用每天2000 rng/kg，染毒14d以上高剂量选用每天1000 rng/峙。如欲外推人群接触的阔剂量，可能需要采用更高的剂量水平。3

16、 GBZ/T 240.12-2011 6.6 试验步骤6.6. 1 实验动物的处理和采样时间点6.6. 1. 1 根据试验目的或受试样品的性质选择染毒途径，宜采用经口灌胃或腹腔注射方式。6.6. 1. 2 受试样品一次给予的最大容量不应超过20mL/kgo 6.6. 1. 3 一般情况下染毒一次，或者为便于大容量给药，也可分散剂量染毒，即同一日染毒两次，其间隔时间不超过几小时。若采用其他染毒方式应予以说明。6.6. 1. 4 高剂量组动物分为A、B两个亚组，分两次采集样品，啃齿类动物采样时间一般为1.5个正常细胞周期的间隔期，即A组于末次染毒后12h18 h采集样品。B组于末次染毒后36h42

17、 h采集样品;中、低剂量组均于末次染毒后12h18 h采集样品。如果采用多次染毒方式，只需在最后一次染毒后12h18 h采一次样。6.6. 1. 5 于处死动物采集样品前3h5 h腹腔注射秋水仙素(4mg/kg)。6.6.2 制片6.6.2. 1 骨髓细胞悬液的制备:用颈椎脱臼法处死动物，迅速取出股骨，剔去肌肉，擦净血污，剪去两端的骨髓，用注射器吸取生理盐水，插入骨髓腔内，将骨髓冲洗入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均匀，以1000 r/min速度离心10min，用滴管吸去上清液。6.6.2.2 低渗:加入0.075mol/L氯化伺溶液9mL，用滴管将细胞轻轻地氓匀，放入370CJj(浴中低

18、渗20 mino 6.6.2.3 预固定:立即加入固定液(甲醇z冰醋酸=3 : 1) 1 mL，混匀，以1000 r/min速度离心10 min，用滴管吸去上清液。6.6.2.4 固定:加入7mL固定液，混匀，固定10min气，20min，以1000 r/min速度离心10min，用滴管吸去上清液。用同法再固定2次。6.6.2.5 加入o.1 mLO. 5 mL新鲜固定液，用细口滴管充分混匀。6.6.2.6 在洁净的冷冻玻片上滴3滴4滴细胞悬液，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上，将玻片在酒精灯上微热烘;晤，空气中自然干燥。每个标本制片2张3张。6.6.2.7 染色z将制备好的标本片放入Giemsa

19、应用液中染色15min20 min，用蒸锢水冲洗、晾干。6.6.3 阅片6.6.3. 1 所有玻片，包括阳性对照和阴性对照，在镜检前要分别编号。6.6.3.2 在低倍镜下检查制片质量，制片应全部染色体较集中，而各个染色体分散、五不重叠、长短收缩适中、两单体分开、清晰地显示出着丝点位置、染色体呈红紫色。用油镜进行细胞中期染色体分析。6.6.3.3 确定有丝分裂指数;包括所有处理组、阴性对照组和阳性对照组(每只动物计数1000个细胞)。6.6.3.4 计数畸变细胞z用双盲法阅片。每只动物至少分析100个分散良好的中期分裂相细胞，每只动物至少分析1000个细胞，测定有丝分裂释放以确定细胞毒性。在阅片

20、时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。6.6.3.5 观察项目:4 a) 染色体数目的改变:非整倍体(亚二倍体或超二倍体)，多倍体，核内复制。b) 染色体结构的改变:断裂、微小体、有着丝点环、元着丝点环、单体互换、双微小体、裂隙和非特定性型变化(如粉碎化、着丝点细长化、粘着等)。GBZ/T 240.12-2011 7 数据处理与结果评价7. 1 数据处理每一实验动物作为一个观察单位，每组动物按性别分别计算染色体结构畸变细胞百分率。若雌、雄动物之间元明显的性别差异时可合并计算结果。一般用卡方检验方法进行统计学分析。裂隙应分别记录和报告，但一般不计人

21、总的畸变率。7.2 结果评价评价时应从生物学意义和统计学意义两个方面进行分析。受试样品组细胞染色体畸变率与阴性对照组相比，细胞染色体结构畸变数增加或异常中期分裂相增加，统计学意义上有显著性差异，并呈剂量反应关系或在一个受试样品组出现染色体畸变细胞数明显增高时，并经重复试验证实，即可认为染色体畸变试验阳性。若统计学上差异有显著性，但无剂量-反应关系，则须进行重复试验，结果能重复者可确定为染色体畸变试验阳性。多倍体的增加提示受试样品具有潜在的诱导染色体数目畸变的作用。核内复制的增加提示受试样品具有潜在的抑制细胞发育的作用。8 评价报告除GBZ!T240.1规定的一般项目外，评价报告还应包括以下内容

22、:a) 受试样品稳定性、配制方法、所用溶剂或载体及其选择的理由、受试样品在溶剂中的溶解度和饱和度;b) 实验动物种属/品系、数量、年龄、性别、试验开始时各动物的体重(包括体重范围、每组动物体重平均值和标准差)、来源(注明合格证号和动物级别); c) 实验动物饲养环境，包括饲料来源(注明合格证号)、饮水质量、室温、相对湿度、动物实验室合格证号;d) 剂量分组及选择剂量的基本原则，阳性和阴性对照资料(包括当前和历史的资料)、染毒途径和方式，采样时点;e) 细胞分裂中期阻断剂名称、使用浓度及处理间隔时间;f) 试验方法:简述操作步骤，所用统计学方法，结果判定标准;g) 结果:中毒症状、有丝分裂指数、

23、每只动物细胞染色体畸变类型和畸变数、每组动物细胞畸变总数及均数和标准差、每组畸变细胞数及均值和标准差、多倍体、剂量-反应关系、阴性对照的参考资料、历史资料及范围、均值和标准差、阳性对照的参考资料等。以列表方式报告受试样品组、溶剂对照组和阳性对照组动物骨髓细胞染色体畸变类型和数量及畸变率;h) 结论。9 结果解释阳性结果表明在本试验条件下受试样品具有引起受试动物骨髓细胞染色体畸变的能力。阴性结果表明在本试验条件下受试样品不引起受试动物骨髓细胞染色体畸变。5 FFONlNF.0寸NHN阁。华人民共和国家职业卫生标准化学晶毒理学评价程序和试验方法第12部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验GBZ/T 240.12-2011 国中* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张0.75字数11千字2011年10月第一次印刷开本880X12301/16 2011年10月第一版秘书号:155066. 2-22225 16.00元定价如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GBZ/T 240.12-2011 打印日期:2011年11月18:-:1F002