DB43 T 1217-2016 中华鳖腐皮病检疫方法.pdf

1、湖南省地方标准DB43DB43/T 12172016 湖南省质量技术监督局 发 布2017-02-13实施2016-12-13 发布中华鳖腐皮病检疫方法 Quarantine methods of skin fester disease insoft-shelled turtleICS 65.020.30B 41DB43/T 12172016 I 目 次 前言1 范围 12 规范性引用文件 13 仪器设备 14 试剂材料 15 实验室用水 16 检疫方法 26.1 流行病学调查 26.2 临诊检查 26.3 病理学检查 26.4 病原分离与鉴定 26.5 检疫结果判定 37 无害化处理 3附录

2、A（资料性附录） 中华鳖腐皮病嗜水气单胞菌16S rRNA扩增产物片段序列 4DB43/T 12172016 II 前 言 本标准按GB/T 1.12009给出的规则编制。 请注意本标准某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。 本标准起草单位：湖南农业大学动物科技学院。 本标准主要起草人：钟蕾、胡毅、曾丹、高志鹏、王晓清、文祝友。 DB43/T 12172016 1 中华鳖腐皮病检疫方法 1 范围 本标准规定了中华鳖腐皮病（Skin fester disease in soft-shelled turtle）检疫的规范性引用文件、仪器

3、设备、试剂材料、实验室用水、检疫方法和无害化处理。 本标准适用于我省中华鳖腐皮病的检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检验方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7105 染疫水生动物无害化处理规程 3 仪器设备 3.1 主要

4、仪器设备 光学显微镜、超净工作台、普通冰箱、电热恒温培养箱（DNP-9162）、超低温冰箱（Premiun U410)、立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50KBS)、普通电子天平（TMP-2)和超纯水仪(AFX1-0501-P)。 3.2 其它仪器设备 应符合SC/T 71034和SC/T 701的规定。 4 试剂材料 细菌基因组DNA提取试剂盒，蛋白酶K，RNase A，TB缓冲液，95%酒精，EDTA（乙二胺四乙酸）、Rnase（核糖核酸酶）、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、SDS（十二烷基磺酸钠）、EB（溴化乙锭）。 其它试剂、染色液和培养基的配制应符合GB/T 4789的规定。 5 实验室

5、用水 培养基的配制用水应符合GB/T 6682中三级水的规格。 DB43/T 12172016 2聚合酶链式反应（PCR）测定用水应符合GB/T 6682中一级水的规格，并经焦碳酸二乙脂（DEPC）处理。 6 检疫方法 6.1 流行病学调查 中华鳖腐皮病是高密度养殖常见的一种传染病，主要病原为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），该菌属于弧菌科气单胞菌属，最适pH为5.59.0，最适水温为（2530）。本病全年均可发生，79月为发病高峰期。高密度养殖发病率更高。稚鳖、幼鳖患此病后可引起大批死亡，成鳖、亲鳖患病后若不继发感染可自愈。此病常与白斑病、疖疮病和细菌性败血病并发，死

6、亡率明显升高。 6.2 临诊检查 发病初期，鳖精神不振，活力减弱，反应迟钝，腹甲轻度充血；发病后期，鳖不进食，常爬上岸，背甲出现溃疡，腿部和裙边明显红肿、糜烂。 6.3 病理学检查 解剖可见腹腔积水，内脏充血，肝脏和胆囊明显肿大，肠道充血，肠腔无食物。病理变化表现为肝脏肝细胞索排列不规则、肝细胞变性、水肿甚至破裂；肠粘膜上皮固有膜分离，柱状细胞肿胀，杯状细胞增多；固有膜中淋巴细胞数目明显增多。 凡符合6.2、6.3检查结果的疫病可判断为疑似中华鳖腐皮病，要确诊应进行病原分离与鉴定。 6.4 病原分离与鉴定 6.4.1 病原的生物学与生理生化鉴定 参照GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检验

7、方法进行。 中华鳖腐皮病患病个体的分离纯化菌，其染色性、形态学特征及生理生化特性检测结果与气单胞菌属基本吻合，但要确定菌种类别，仍需进行分子生物学鉴定。 6.4.2 病原的 16S rRNA基因鉴定 6.4.2.1 16S rRNA基因片段的扩增及琼脂糖凝胶电泳 直接取未被污染的分离菌液作为模板，全过程在无菌操作台中进行。用于 16S rRNA基因PCR扩增的的引物为: 27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3） 1429R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3） 反应总体系25L，其中包括菌液模板1L，两种引物各0.5L，MIX12.5L，ddH2O10.5L。 P

8、CR扩增程序如下：94预变性5分钟，94变性30s，56退火30s，72延伸70s，30个循环，再72延伸10分钟，最后12终结。 PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，电压120V，电流72mA，电泳结果在凝胶成像系统下观察，扩增出1500bp左右的条带。 6.4.2.2 16S rRNA基因序列测定 DB43/T 12172016 3 基因序列送往测序公司进行测序，并返回测序结果。 6.4.2.3 序列的数据处理 将测序结果输入到NCBI网站（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/），利用BLAST工具，对序列进行同源性比对分析，分离菌株与嗜水气单胞菌的同源性达到95%

9、以上。 序列结果参见附录A。 6.5 检疫结果判定 疑似中华鳖腐皮病的中华鳖，其病原检测结果同时符合6.4.1和6.4.2，则可最终判定中华鳖腐皮病的病原为嗜水气单胞菌。 7 无害化处理 按SC/T 7105 的规定执行。DB43/T 12172016 4附录A （资料性附录） 中华鳖腐皮病嗜水气单胞菌16S rRNA扩增产物片段序列 序号 测序结果 1 agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 61 ggcagcggga aagtagcttg ctacttttgc cggcgagcgg cggacggg

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