1、湖南省地方标准DB43DB43/T 12172016 湖南省质量技术监督局 发 布2017-02-13实施2016-12-13 发布中华鳖腐皮病检疫方法 Quarantine methods of skin fester disease insoft-shelled turtleICS 65.020.30B 41DB43/T 12172016 I 目 次 前言1 范围 12 规范性引用文件 13 仪器设备 14 试剂材料 15 实验室用水 16 检疫方法 26.1 流行病学调查 26.2 临诊检查 26.3 病理学检查 26.4 病原分离与鉴定 26.5 检疫结果判定 37 无害化处理 3附录
2、A（资料性附录） 中华鳖腐皮病嗜水气单胞菌16S rRNA扩增产物片段序列 4DB43/T 12172016 II 前 言 本标准按GB/T 1.12009给出的规则编制。 请注意本标准某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。 本标准起草单位：湖南农业大学动物科技学院。 本标准主要起草人：钟蕾、胡毅、曾丹、高志鹏、王晓清、文祝友。 DB43/T 12172016 1 中华鳖腐皮病检疫方法 1 范围 本标准规定了中华鳖腐皮病（Skin fester disease in soft-shelled turtle）检疫的规范性引用文件、仪器
3、设备、试剂材料、实验室用水、检疫方法和无害化处理。 本标准适用于我省中华鳖腐皮病的检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检验方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7105 染疫水生动物无害化处理规程 3 仪器设备 3.1 主要
4、仪器设备 光学显微镜、超净工作台、普通冰箱、电热恒温培养箱（DNP-9162）、超低温冰箱（Premiun U410)、立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50KBS)、普通电子天平（TMP-2)和超纯水仪(AFX1-0501-P)。 3.2 其它仪器设备 应符合SC/T 71034和SC/T 701的规定。 4 试剂材料 细菌基因组DNA提取试剂盒，蛋白酶K，RNase A，TB缓冲液，95%酒精，EDTA（乙二胺四乙酸）、Rnase（核糖核酸酶）、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、SDS（十二烷基磺酸钠）、EB（溴化乙锭）。 其它试剂、染色液和培养基的配制应符合GB/T 4789的规定。 5 实验室
5、用水 培养基的配制用水应符合GB/T 6682中三级水的规格。 DB43/T 12172016 2聚合酶链式反应（PCR）测定用水应符合GB/T 6682中一级水的规格，并经焦碳酸二乙脂（DEPC）处理。 6 检疫方法 6.1 流行病学调查 中华鳖腐皮病是高密度养殖常见的一种传染病，主要病原为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），该菌属于弧菌科气单胞菌属，最适pH为5.59.0，最适水温为（2530）。本病全年均可发生，79月为发病高峰期。高密度养殖发病率更高。稚鳖、幼鳖患此病后可引起大批死亡，成鳖、亲鳖患病后若不继发感染可自愈。此病常与白斑病、疖疮病和细菌性败血病并发，死
6、亡率明显升高。 6.2 临诊检查 发病初期，鳖精神不振，活力减弱，反应迟钝，腹甲轻度充血；发病后期，鳖不进食，常爬上岸，背甲出现溃疡，腿部和裙边明显红肿、糜烂。 6.3 病理学检查 解剖可见腹腔积水，内脏充血，肝脏和胆囊明显肿大，肠道充血，肠腔无食物。病理变化表现为肝脏肝细胞索排列不规则、肝细胞变性、水肿甚至破裂；肠粘膜上皮固有膜分离，柱状细胞肿胀，杯状细胞增多；固有膜中淋巴细胞数目明显增多。 凡符合6.2、6.3检查结果的疫病可判断为疑似中华鳖腐皮病，要确诊应进行病原分离与鉴定。 6.4 病原分离与鉴定 6.4.1 病原的生物学与生理生化鉴定 参照GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检验
7、方法进行。 中华鳖腐皮病患病个体的分离纯化菌，其染色性、形态学特征及生理生化特性检测结果与气单胞菌属基本吻合，但要确定菌种类别，仍需进行分子生物学鉴定。 6.4.2 病原的 16S rRNA基因鉴定 6.4.2.1 16S rRNA基因片段的扩增及琼脂糖凝胶电泳 直接取未被污染的分离菌液作为模板，全过程在无菌操作台中进行。用于 16S rRNA基因PCR扩增的的引物为: 27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3） 1429R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3） 反应总体系25L，其中包括菌液模板1L，两种引物各0.5L，MIX12.5L，ddH2O10.5L。 P
8、CR扩增程序如下：94预变性5分钟，94变性30s，56退火30s，72延伸70s，30个循环，再72延伸10分钟，最后12终结。 PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，电压120V，电流72mA，电泳结果在凝胶成像系统下观察，扩增出1500bp左右的条带。 6.4.2.2 16S rRNA基因序列测定 DB43/T 12172016 3 基因序列送往测序公司进行测序，并返回测序结果。 6.4.2.3 序列的数据处理 将测序结果输入到NCBI网站（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/），利用BLAST工具，对序列进行同源性比对分析，分离菌株与嗜水气单胞菌的同源性达到95%
9、以上。 序列结果参见附录A。 6.5 检疫结果判定 疑似中华鳖腐皮病的中华鳖，其病原检测结果同时符合6.4.1和6.4.2，则可最终判定中华鳖腐皮病的病原为嗜水气单胞菌。 7 无害化处理 按SC/T 7105 的规定执行。DB43/T 12172016 4附录A （资料性附录） 中华鳖腐皮病嗜水气单胞菌16S rRNA扩增产物片段序列 序号 测序结果 1 agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 61 ggcagcggga aagtagcttg ctacttttgc cggcgagcgg cggacggg
10、tg agtaatgcct 121 gggaaattgc ccagtcgagg gggataacag ttggaaacga ctgctaatac cgcatacgcc 181 ctacggggga aagcagggga ccttcgggcc ttgcgcgatt ggatatgccc aggtgggatt 241 agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg 301 atcagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 361 at
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