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DB13 T 2051-2014 幼羔体外胚胎生产技术规程.pdf

1、ICS 65.020.30 B 40 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 20512014 幼羔体外胚胎生产技术规程 2014 - 07 - 07 发布 2014 - 07 - 31 实施河北省质量技术监督局 发 布DB13/T 20512014 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北农业大学提出。 本标准起草单位:河北农业大学、河北省牛羊胚胎工程技术研究中心。 本标准主要起草人:田树军、孙树春、金东航、陈晓勇、敦伟涛、贾日东、孟娜娜、刘梦鹤、王春霞、李捷鑫。 DB13/T 20512014 1 幼羔体外胚胎生产技术规程 1 范围 本标

2、准规定了幼羔体外胚胎生产的供体选择、幼羔超数排卵、采集卵丘卵母细胞复合体、体外成熟培养、体外受精、体外胚胎发育培养和胚胎质量检测。 本标准适用于利用幼龄羔羊作为供体,进行诱导卵泡发育、活体采集卵丘卵母细胞复合体及体外胚胎生产及科学研究。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 NY/T 1674-2008 牛羊胚胎质量检测技术规程 3 术语及定义 3.1 供体 出生后410周龄的雌性羔羊。 3.2 诱导卵泡发育 供体经过外源促性腺激素处理,使

3、其卵巢较在自然状态下有大量卵泡发育的技术。 3.3 体外胚胎 从供体所采集的卵丘卵母细胞复合体经体外成熟、体外受精及体外胚胎发育培养所获得的胚胎。 4 供体选择 要求健康、体况发育良好、系谱资料完整清楚、出生410周龄的雌性羔羊。 5 诱导卵泡发育 5.1 所使用的生殖激素 促卵泡素(FSH)和孕马血清促性腺激素(PMSG)。 5.2 诱导卵泡发育方法 DB13/T 20512014 2 间隔12h对供体连续4次进行等剂量肌肉注射FSH。FSH的总剂量:FSH(宁波市三生药业有限公司)为280300 IU,FSH(加拿大BIONICHE)为160200mg。在第一次注射FSH的同时,肌肉注射P

4、MSG 500IU。 6 采集卵丘卵母细胞复合体 6.1 采集时间 于最后一次注射FSH后的12h16h。 6.2 采卵前准备 6.2.1 采卵室及检卵室准备 采集前,先将采卵室及检卵室打扫干净,用来苏水等消毒液泼洒地面,关闭门窗,紫外灯照射消毒。采卵室及检卵室适宜温度为2025。 6.2.2 手术器材及药品准备 6.2.2.1 手术器材 6.2.2.1.1 手术器械(1套):手术刀柄1把,20号刀片,直尖手术剪2把,无齿手术镊1把,有齿手术镊1把,止血钳4把(2把弯止血钳、2把直止血钳),持针钳2把(握式持针钳或钳式持针钳),创巾钳6把;止血纱布6块(以上器械用0.1新洁尔灭溶液在解剖盘内浸

5、泡消毒30min或高压消毒1520min),缝合针(弯三棱针2个、弯圆针2个),缝合线(10号、7号若干),针盒1个(以上器械用70酒精在针盒内浸泡30min);剪毛剪1把,剃须刀1片,大止血钳1把或人用剃须刀具1个(剃毛用)、保定架2个、水浴锅1个、500mL的喷壶3个,15mL的试管架1个,15mL离心管若干、一次性创巾若干,一次性注射器若干(20mL、10 mL、5mL、2mL、1mL),18G注射针头若干。 6.2.2.2 药品 含0.9%NaCl的生理盐水,含有0.96万IU青霉素/mL和0.2万IU/mL链霉素的生理盐水,速眠新及苏醒灵,注射用青霉素和链霉素,75酒精棉球,5碘酊棉

6、球,碘甘油,5新洁尔灭溶液,以及采卵液(每只供体准备100mL)。 采卵液配方:9.5g/L TCM199 +5mmol/L NaHCO3+10mmol/L HEPES+10mmol/L HEPES-Na +0.665g/L肝素钠+20ml/L FBS +0.065g/L青霉素+0.05g/L链霉素。 6.2.3 手术人员准备 手术人员(术者、助手)戴好手术帽和口罩,洗净手及手臂,穿戴好手术衣,手、手臂在盛有0.1新洁尔灭溶液的泡手桶中浸泡5min,除去手上多余药液,稍后自然干燥,再戴上干燥的无菌手套。 6.3 保定与麻醉 供体肌肉注射速眠新进行全身麻醉,剂量:杜泊绵羊、无角道塞特、夏洛来、特

7、克塞尔等肉用绵羊为0.015mL0.022mL/kg体重;波尔山羊等肉用山羊为0.020mL0.030mL/kg体重;奶山羊、绒山羊为0.023mL0.033mL/kg体重;小尾寒羊为0.017mL0.023mL/kg体重。供体麻醉后在手术架上仰卧保定。 6.4 术部除毛 DB13/T 20512014 3 手术部位(简称“术部”)是在脐后部至乳房基部腹白线处或腹白线旁。先用剪毛剪将术部羊毛剪短,再用温肥皂水浸湿,然后用剃须刀将毛剃净,术部剃毛范围为15cm220cm2,用清水洗净擦干。 6.5 术部消毒 术部用5%碘酊棉球涂擦,待其干燥后,用75%酒精棉球脱碘。然后用有孔创巾覆盖于术部区域,

8、用创巾钳固定。 6.6 采集卵丘卵母细胞复合体 外科手术打开腹腔,引出卵巢,用带有18G注射针头且吸有约5mL采卵液的10mL注射器抽吸卵巢上的卵泡,当注射器中的抽卵液颜色变浅或略显浑浊时,立即将含有卵丘卵母细胞复合体的抽卵液注入15mL离心管,并放入水浴锅中保存。一侧卵巢卵丘卵母细胞复合体采集完后送入检卵室,再采集另一侧。完毕后,两侧卵巢表面均涂抹碘甘油,送回腹腔,缝合切口,用碘酊棉球消毒创口,并做结系绷带。肌注苏醒灵,剂量为速眠新用量的12倍。肌注青霉素160万IU和链霉素100万IU。 7 体外成熟培养 7.1 成熟液预平衡 在3.5cm(Nunc)培养皿上标记组别、日期等,做100L的

9、培养滴,覆盖矿物油。另取一只1.5mL离心管,吸取1mL的成熟液放入离心管中。将平皿和离心管(开盖)放入38.5、饱和湿度的5%CO2培养箱中,预平衡24h。 体外成熟培养液配方:84.9%TCM199(v/v )+10% FBS(v/v)+10 g/mL FSH+10 g/mL LH +1 g/mL E2+1 mmol/L L-谷氨酰胺 + 20 ng/mL EGF + 200mol /L 丙酮酸钠 + 100mol/L 半胱氨酸。 7.2 回收卵丘卵母细胞复合体 提前打开恒温台调至38.5并用75%酒精消毒,分别取3cm、9cm塑料平皿(国产)各4个、5个,将9cm平皿底部划上宽度间隔约为

10、0.7cm的线条。 将含有卵丘卵母细胞复合体的采卵液(15mL离心管内)倒入平皿中,然后在显微镜下捡出卵丘卵母细胞复合体,并移入盛有采卵液的3cm平皿中。形态正常、胞质均匀和颗粒细胞不低于3层的卵丘卵母细胞复合体为可用卵丘卵母细胞复合体。 7.3 卵细胞体外成熟 取经过预平衡的成熟液在培养皿中做液滴45个,每个液滴的体积为100L,依次洗涤卵丘卵母细胞复合体,然后将卵丘卵母细胞复合体入孵到覆盖石蜡油的成熟液微滴中,每滴15枚。放于38.5、饱和湿度的5% CO2培养箱中,成熟培养24h。 8 体外受精 8.1 受精液预平衡 DB13/T 20512014 4 在3.5cm(Nunc)培养皿上标

11、记组别、日期等,做30L的受精滴,覆盖石蜡油。另取一只1.5mL离心管,吸取1mL的受精液放入离心管中,做好标记,用于洗涤精子,必要时调整精子密度。取1个4mL离心管,装2mL的SOF液,用于精子上浮。取1个200L的离心管装100L的0.1%透明质酸酶,将平皿和离心管(受精液开盖,SOF液盖盖)放入38.5,饱和湿度的5%CO2培养箱中,预平衡2h4h。 体外受精液配方:SOF液+20%发情羊血清(v/v)+10g/mL肝素钠。 其中SOF液配方:10%StockA(v/v)+5.262mmol/L NaHCO3+200mol /L 丙酮酸钠+ 1.782 mmol/L CaCl22 H2O

12、 +8%StockE(v/v)+2%发情羊血清(v/v) 8.2 精液处理 8.2.1 冷冻精液的处理 37水浴解冻,用200L移液枪吸取200L精液并缓慢注入SOF液底部(4mL离心管),倾斜30度角,开口放入培养箱中上浮30min40min。将上浮完毕的精液,取上清放入1.5mL离心管中,1000rpm,离心8min。弃上清,用受精液调整精子密度为1.0106为宜。 8.2.2 新鲜精液的处理 新鲜精液用200uL移液枪吸取直接进行精子上浮。上浮操作方法同冷冻精液。 8.3 脱除卵丘颗粒细胞 将体外成熟的卵丘卵母细胞复合体放入预热至38.5的0.1%透明质酸酶液滴中,用口吸管轻轻吹打脱除卵

13、丘颗粒细胞至23层为宜。 8.4 体外受精 将脱除卵丘颗粒细胞的卵丘卵母细胞复合体在受精液中洗34遍后,放入受精液微滴中,每滴15枚卵细胞,加入20L经过处理的精液。体外受精的适宜精子密度为1.0106,于38.5、5%CO2及饱和湿度条件下精卵共孵育24h。 9 体外胚胎发育培养 9.1 胚胎发育液预平衡 在3.5cm(Nunc)培养皿上标记组别、日期等,做50L的发育培养I液微滴,覆盖石蜡油(3mL)。另取一只1.5mL离心管,吸取1mL的发育培养I液放入离心管中,做好标记。将平皿和离心管(开盖)放入38.5、饱和湿度的5%CO2培养箱中,预平衡2h4h。发育液配方如下: 发育培养液:SO

14、F液+1% EAA+1% NEAA +10ng/mL EGF +1mmol/L L-谷氨酰胺+8mg/mL BSA。 发育培养II液: I液+10%FBS(v/v)+1% EAA 发育培养III液: I液+10%FBS(v/v)+1% EAA+1%StockF 9.2 脱除精子及卵丘颗粒细胞 DB13/T 20512014 5 先将1.5mL离心管中的发育培养I液做滴,取出受精24h的受精卵,在发育液滴里用口吸管反复吹打,去除周边的死精子和卵丘颗粒细胞,清洗34遍,然后放入发育培养液微滴中,置于38.5、饱和湿度的混合气(5% CO2,5% O2,90% N2)培养箱中培养。 9.3 更换发育

15、液 于受精72h后半量换发育培养II液,受精120h半量换发育培养III液培养。发育培养皿装入一密封塑料袋中,袋内置入湿棉球并充入混合气(5% CO2,5% O2,90% N2),放入 38.5、饱和湿度的5% CO2培养箱中培养。之后,于受精第5d统计桑椹胚率,第7d8d统计囊胚率。 10 胚胎质量检测 按照NY/T 1674-2008规定,评定胚胎发育阶段及胚胎质量等级。 DB13/T 20512014 6 A A 附 录 A (资料性附录) 各种浓储液配方 A.1 Stock A 10 成分 用量 NaCl 6.29g KCl 0.534g KH2PO40.162g MgSO4-7H2O

16、 0.182g 链霉素 0.05g 青霉素 0.065g 乳酸钠 0.6mL 加水定容至100mL,4保存。 A.2 Stock B 10 成分 用量 NaHCO3 0.221g 水 10mL A.3 Stock C 100 成分 用量 Napyruvate 0.044g 水 10mL A.4 Stock D 100 成分 用量 CaCl2-2 H2O 0.262g 水 10mL A.5 Stock E 100 成分 用量 Hepes 0.32554g HEPES-Na 0.35556g 水 10mL DB13/T 20512014 7 A.6 Stock F 100 成分 用量 Glucos

17、e 0.27g 水 10mL A.7 肝素钠 100 成分 用量 肝素钠 0.01g 水 10mL A.8 E2 1000 成分 用量 E20.01g 100%酒精 10mL DB13/T 20512014 8 B B 附 录 B (资料性附录) 各种培养液及操作液配方 B.1 成熟液配方 成分 用量 M199 8.65mL FBS 1.0mL FSH 100L LH 100L 丙酮酸钠 50L L-谷氨酰胺 50L EGF 20L 半胱胺酸 100L E210L 混匀后,用一次性滤器(0.20m)过滤,4保存。 B.2 精子上浮液配方 成分 用量 水 7.8mL Stock A 1.0mL

18、Stock B 0.2mL Stock C 0.1mL Stock D 0.1mL Stock E 0.8mL 将其混匀,弃去0.2mL 血清 0.2mL 过滤(0.20m滤器),4保存。 DB13/T 20512014 9 B.3 受精液配方 成分 用量 纯水 7.8mL Stock A 1.0mL Stock B 1.0mL Stock C 0.1mL Stock D 0.1mL 混匀,弃2.1mL 血清(20%V/V ) 2mL 肝素钠(10ug/mL) 0.1mL 过滤(0.20m滤器),4保存。 B.4 发育培养液配方 B.4.1.1 发育培养I液 成分 用量 水 7.45mL Stock A 1.0mL Stock B 1.0mL Stock C 100L Stock D 100L 非必需氨基酸 100L 必需氨基酸 100L EGF 100L L-谷氨酰胺 50L BSA 0.08g 静置溶解,混匀,过滤(0.20m滤器),4保存。 DB13/T 20512014 10 B.4.2 发育培养II液 成分 用量 发育培养I液 0.89 mL FBS 100 L 必需氨基酸 10 L B.4.3 发育培养III液 成分 用量 发育培养I液 0.88 mL FBS 100 L 必需氨基酸 10 L Stock F 10 L _

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