1、ICS 65.020.30 B 40 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 20512014 幼羔体外胚胎生产技术规程 2014 - 07 - 07 发布 2014 - 07 - 31 实施河北省质量技术监督局 发 布DB13/T 20512014 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北农业大学提出。 本标准起草单位：河北农业大学、河北省牛羊胚胎工程技术研究中心。 本标准主要起草人：田树军、孙树春、金东航、陈晓勇、敦伟涛、贾日东、孟娜娜、刘梦鹤、王春霞、李捷鑫。 DB13/T 20512014 1 幼羔体外胚胎生产技术规程 1 范围 本标
2、准规定了幼羔体外胚胎生产的供体选择、幼羔超数排卵、采集卵丘卵母细胞复合体、体外成熟培养、体外受精、体外胚胎发育培养和胚胎质量检测。 本标准适用于利用幼龄羔羊作为供体，进行诱导卵泡发育、活体采集卵丘卵母细胞复合体及体外胚胎生产及科学研究。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1674-2008 牛羊胚胎质量检测技术规程 3 术语及定义 3.1 供体 出生后410周龄的雌性羔羊。 3.2 诱导卵泡发育 供体经过外源促性腺激素处理，使
3、其卵巢较在自然状态下有大量卵泡发育的技术。 3.3 体外胚胎 从供体所采集的卵丘卵母细胞复合体经体外成熟、体外受精及体外胚胎发育培养所获得的胚胎。 4 供体选择 要求健康、体况发育良好、系谱资料完整清楚、出生410周龄的雌性羔羊。 5 诱导卵泡发育 5.1 所使用的生殖激素 促卵泡素（FSH）和孕马血清促性腺激素（PMSG）。 5.2 诱导卵泡发育方法 DB13/T 20512014 2 间隔12h对供体连续4次进行等剂量肌肉注射FSH。FSH的总剂量：FSH（宁波市三生药业有限公司）为280300 IU，FSH（加拿大BIONICHE）为160200mg。在第一次注射FSH的同时，肌肉注射P
4、MSG 500IU。 6 采集卵丘卵母细胞复合体 6.1 采集时间 于最后一次注射FSH后的12h16h。 6.2 采卵前准备 6.2.1 采卵室及检卵室准备 采集前，先将采卵室及检卵室打扫干净，用来苏水等消毒液泼洒地面，关闭门窗，紫外灯照射消毒。采卵室及检卵室适宜温度为2025。 6.2.2 手术器材及药品准备 6.2.2.1 手术器材 6.2.2.1.1 手术器械（1套）：手术刀柄1把，20号刀片，直尖手术剪2把，无齿手术镊1把，有齿手术镊1把，止血钳4把（2把弯止血钳、2把直止血钳），持针钳2把（握式持针钳或钳式持针钳），创巾钳6把；止血纱布6块（以上器械用0.1新洁尔灭溶液在解剖盘内浸
5、泡消毒30min或高压消毒1520min），缝合针（弯三棱针2个、弯圆针2个），缝合线（10号、7号若干），针盒1个（以上器械用70酒精在针盒内浸泡30min）；剪毛剪1把，剃须刀1片，大止血钳1把或人用剃须刀具1个（剃毛用）、保定架2个、水浴锅1个、500mL的喷壶3个，15mL的试管架1个，15mL离心管若干、一次性创巾若干，一次性注射器若干（20mL、10 mL、5mL、2mL、1mL），18G注射针头若干。 6.2.2.2 药品 含0.9%NaCl的生理盐水，含有0.96万IU青霉素/mL和0.2万IU/mL链霉素的生理盐水，速眠新及苏醒灵，注射用青霉素和链霉素，75酒精棉球，5碘酊棉
6、球，碘甘油，5新洁尔灭溶液，以及采卵液（每只供体准备100mL）。 采卵液配方：9.5g/L TCM199 +5mmol/L NaHCO3+10mmol/L HEPES+10mmol/L HEPES-Na +0.665g/L肝素钠+20ml/L FBS +0.065g/L青霉素+0.05g/L链霉素。 6.2.3 手术人员准备 手术人员（术者、助手）戴好手术帽和口罩，洗净手及手臂，穿戴好手术衣，手、手臂在盛有0.1新洁尔灭溶液的泡手桶中浸泡5min，除去手上多余药液，稍后自然干燥，再戴上干燥的无菌手套。 6.3 保定与麻醉 供体肌肉注射速眠新进行全身麻醉，剂量：杜泊绵羊、无角道塞特、夏洛来、特
7、克塞尔等肉用绵羊为0.015mL0.022mL/kg体重；波尔山羊等肉用山羊为0.020mL0.030mL/kg体重；奶山羊、绒山羊为0.023mL0.033mL/kg体重；小尾寒羊为0.017mL0.023mL/kg体重。供体麻醉后在手术架上仰卧保定。 6.4 术部除毛 DB13/T 20512014 3 手术部位（简称“术部”）是在脐后部至乳房基部腹白线处或腹白线旁。先用剪毛剪将术部羊毛剪短，再用温肥皂水浸湿，然后用剃须刀将毛剃净，术部剃毛范围为15cm220cm2，用清水洗净擦干。 6.5 术部消毒 术部用5%碘酊棉球涂擦，待其干燥后，用75%酒精棉球脱碘。然后用有孔创巾覆盖于术部区域，
8、用创巾钳固定。 6.6 采集卵丘卵母细胞复合体 外科手术打开腹腔，引出卵巢，用带有18G注射针头且吸有约5mL采卵液的10mL注射器抽吸卵巢上的卵泡，当注射器中的抽卵液颜色变浅或略显浑浊时，立即将含有卵丘卵母细胞复合体的抽卵液注入15mL离心管，并放入水浴锅中保存。一侧卵巢卵丘卵母细胞复合体采集完后送入检卵室，再采集另一侧。完毕后，两侧卵巢表面均涂抹碘甘油，送回腹腔，缝合切口，用碘酊棉球消毒创口，并做结系绷带。肌注苏醒灵，剂量为速眠新用量的12倍。肌注青霉素160万IU和链霉素100万IU。 7 体外成熟培养 7.1 成熟液预平衡 在3.5cm（Nunc）培养皿上标记组别、日期等，做100L的
9、培养滴，覆盖矿物油。另取一只1.5mL离心管，吸取1mL的成熟液放入离心管中。将平皿和离心管（开盖）放入38.5、饱和湿度的5%CO2培养箱中，预平衡24h。 体外成熟培养液配方：84.9%TCM199（v/v ）+10% FBS(v/v)+10 g/mL FSH+10 g/mL LH +1 g/mL E2+1 mmol/L L-谷氨酰胺 + 20 ng/mL EGF + 200mol /L 丙酮酸钠 + 100mol/L 半胱氨酸。 7.2 回收卵丘卵母细胞复合体 提前打开恒温台调至38.5并用75%酒精消毒，分别取3cm、9cm塑料平皿（国产）各4个、5个，将9cm平皿底部划上宽度间隔约为
10、0.7cm的线条。 将含有卵丘卵母细胞复合体的采卵液（15mL离心管内）倒入平皿中，然后在显微镜下捡出卵丘卵母细胞复合体，并移入盛有采卵液的3cm平皿中。形态正常、胞质均匀和颗粒细胞不低于3层的卵丘卵母细胞复合体为可用卵丘卵母细胞复合体。 7.3 卵细胞体外成熟 取经过预平衡的成熟液在培养皿中做液滴45个，每个液滴的体积为100L，依次洗涤卵丘卵母细胞复合体，然后将卵丘卵母细胞复合体入孵到覆盖石蜡油的成熟液微滴中，每滴15枚。放于38.5、饱和湿度的5% CO2培养箱中，成熟培养24h。 8 体外受精 8.1 受精液预平衡 DB13/T 20512014 4 在3.5cm（Nunc）培养皿上标
11、记组别、日期等，做30L的受精滴，覆盖石蜡油。另取一只1.5mL离心管，吸取1mL的受精液放入离心管中，做好标记，用于洗涤精子，必要时调整精子密度。取1个4mL离心管，装2mL的SOF液，用于精子上浮。取1个200L的离心管装100L的0.1%透明质酸酶，将平皿和离心管（受精液开盖，SOF液盖盖）放入38.5，饱和湿度的5%CO2培养箱中，预平衡2h4h。 体外受精液配方：SOF液+20%发情羊血清（v/v）+10g/mL肝素钠。 其中SOF液配方：10%StockA（v/v）+5.262mmol/L NaHCO3+200mol /L 丙酮酸钠+ 1.782 mmol/L CaCl22 H2O
12、 +8%StockE(v/v)+2%发情羊血清（v/v） 8.2 精液处理 8.2.1 冷冻精液的处理 37水浴解冻，用200L移液枪吸取200L精液并缓慢注入SOF液底部（4mL离心管），倾斜30度角，开口放入培养箱中上浮30min40min。将上浮完毕的精液，取上清放入1.5mL离心管中，1000rpm，离心8min。弃上清，用受精液调整精子密度为1.0106为宜。 8.2.2 新鲜精液的处理 新鲜精液用200uL移液枪吸取直接进行精子上浮。上浮操作方法同冷冻精液。 8.3 脱除卵丘颗粒细胞 将体外成熟的卵丘卵母细胞复合体放入预热至38.5的0.1%透明质酸酶液滴中，用口吸管轻轻吹打脱除卵
13、丘颗粒细胞至23层为宜。 8.4 体外受精 将脱除卵丘颗粒细胞的卵丘卵母细胞复合体在受精液中洗34遍后，放入受精液微滴中，每滴15枚卵细胞，加入20L经过处理的精液。体外受精的适宜精子密度为1.0106，于38.5、5%CO2及饱和湿度条件下精卵共孵育24h。 9 体外胚胎发育培养 9.1 胚胎发育液预平衡 在3.5cm（Nunc）培养皿上标记组别、日期等，做50L的发育培养I液微滴，覆盖石蜡油（3mL）。另取一只1.5mL离心管，吸取1mL的发育培养I液放入离心管中，做好标记。将平皿和离心管（开盖）放入38.5、饱和湿度的5%CO2培养箱中，预平衡2h4h。发育液配方如下： 发育培养液：SO
14、F液+1% EAA+1% NEAA +10ng/mL EGF +1mmol/L L-谷氨酰胺+8mg/mL BSA。 发育培养II液： I液+10%FBS（v/v）+1% EAA 发育培养III液： I液+10%FBS（v/v）+1% EAA+1%StockF 9.2 脱除精子及卵丘颗粒细胞 DB13/T 20512014 5 先将1.5mL离心管中的发育培养I液做滴，取出受精24h的受精卵，在发育液滴里用口吸管反复吹打，去除周边的死精子和卵丘颗粒细胞，清洗34遍，然后放入发育培养液微滴中，置于38.5、饱和湿度的混合气(5% CO2，5% O2，90% N2)培养箱中培养。 9.3 更换发育
15、液 于受精72h后半量换发育培养II液，受精120h半量换发育培养III液培养。发育培养皿装入一密封塑料袋中，袋内置入湿棉球并充入混合气(5% CO2，5% O2，90% N2)，放入 38.5、饱和湿度的5% CO2培养箱中培养。之后，于受精第5d统计桑椹胚率，第7d8d统计囊胚率。 10 胚胎质量检测 按照NY/T 1674-2008规定，评定胚胎发育阶段及胚胎质量等级。 DB13/T 20512014 6 A A 附 录 A （资料性附录） 各种浓储液配方 A.1 Stock A 10 成分 用量 NaCl 6.29g KCl 0.534g KH2PO40.162g MgSO4-7H2O
16、 0.182g 链霉素 0.05g 青霉素 0.065g 乳酸钠 0.6mL 加水定容至100mL，4保存。 A.2 Stock B 10 成分 用量 NaHCO3 0.221g 水 10mL A.3 Stock C 100 成分 用量 Napyruvate 0.044g 水 10mL A.4 Stock D 100 成分 用量 CaCl2-2 H2O 0.262g 水 10mL A.5 Stock E 100 成分 用量 Hepes 0.32554g HEPES-Na 0.35556g 水 10mL DB13/T 20512014 7 A.6 Stock F 100 成分 用量 Glucos
17、e 0.27g 水 10mL A.7 肝素钠 100 成分 用量 肝素钠 0.01g 水 10mL A.8 E2 1000 成分 用量 E20.01g 100%酒精 10mL DB13/T 20512014 8 B B 附 录 B （资料性附录） 各种培养液及操作液配方 B.1 成熟液配方 成分 用量 M199 8.65mL FBS 1.0mL FSH 100L LH 100L 丙酮酸钠 50L L-谷氨酰胺 50L EGF 20L 半胱胺酸 100L E210L 混匀后，用一次性滤器（0.20m）过滤，4保存。 B.2 精子上浮液配方 成分 用量 水 7.8mL Stock A 1.0mL
18、Stock B 0.2mL Stock C 0.1mL Stock D 0.1mL Stock E 0.8mL 将其混匀，弃去0.2mL 血清 0.2mL 过滤（0.20m滤器），4保存。 DB13/T 20512014 9 B.3 受精液配方 成分 用量 纯水 7.8mL Stock A 1.0mL Stock B 1.0mL Stock C 0.1mL Stock D 0.1mL 混匀，弃2.1mL 血清(20%V/V ) 2mL 肝素钠(10ug/mL) 0.1mL 过滤（0.20m滤器），4保存。 B.4 发育培养液配方 B.4.1.1 发育培养I液 成分 用量 水 7.45mL Stock A 1.0mL Stock B 1.0mL Stock C 100L Stock D 100L 非必需氨基酸 100L 必需氨基酸 100L EGF 100L L-谷氨酰胺 50L BSA 0.08g 静置溶解，混匀，过滤（0.20m滤器），4保存。 DB13/T 20512014 10 B.4.2 发育培养II液 成分 用量 发育培养I液 0.89 mL FBS 100 L 必需氨基酸 10 L B.4.3 发育培养III液 成分 用量 发育培养I液 0.88 mL FBS 100 L 必需氨基酸 10 L Stock F 10 L _
