CNS 11737-2007 Method of test for milk and milk products - Detection of vegetable fat in milk fat《乳品检验法－乳脂肪中植物油脂之检出》.pdf

1、1 印月961月 本標準非經本局同意得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 號 ICS 67.100 N620311737經濟部標準檢驗局印 公布日期 修訂公布日期 7510月24日 961月19日 (共6頁)乳品檢驗法乳脂肪中植物油脂之檢出 Method of test for milk and milk products Detection for vegetable fat in milkfat 1. 適用範圍：本標準規定乳脂肪中添加植物油脂之測定方法。 2. 檢驗方法：乳脂肪中植物油脂之檢出可採用氣相層析法（ GC 法）或固醇醋酸鹽法。如其結果發生紛歧時，以 GC 法為準。 2.1 氣

2、相層析法 (gas chromatography， GC) 2.1.1 裝置、器具及材料 2.1.1.1 氣相層析儀 2.1.1.1.1 偵檢器：氫焰離子化偵檢器 (Flame ionization detector)。 2.1.1.1.2 層析管柱：內徑 2 4 mm，長度 100 200 cm 之玻璃管或同等級品，層析管用填充劑為 Chromosorb W. AW. DMCS (80100 mesh/ 100 120 mesh )上覆被有 Methylesilicon SE-30， 240%。 2.1.1.1.3 注入器：溫度應較層析管柱溫度高 20 40。 2.1.1.1.4 移動相氣體

3、： N2，流速 30 60 mL / min。 2.1.1.2 分析天平：精確至 0.0001 g。 2.1.1.3 三角燒瓶：容量為 500 mL，瓶口可裝上空氣冷凝管。 2.1.2 試藥 2.1.2.1 甲醯胺 (formamide)及二甲基代甲醯胺液 (N. N. dimethyl formamide)：等容混合。 2.1.2.2 正戊烷或石油醚。 2.1.2.3 氫氧化鉀溶液：溶解氫氧化鉀 400 g 於水 600 mL 中。 2.1.2.4 洋地黃皂苷酒精溶液 (ethanolic digitonin)：稱取洋地黃皂苷10 g 溶於95% (v/v)乙醇 1L 中。 2.1.2.5

4、硫酸銅溶液：稱取硫酸銅 (CuSO45 H2O)溶於蒸餾水 1 L 中。 2.1.2.6 乙醇： 95% (v/v)。 2.1.2.7 乙醚。 2.1.2.8 無水硫酸鈉。 2.1.3 步驟 2.1.3.1 試樣的調製 2.1.3.1.1 乳酪 (Butter)：取約 50 g 乳酪在 50以下熔融，直至脂肪與水層分離為止，趁熱濾取脂肪層。 2 CNS 11737, N 6203 2.1.3.1.2 乳及乳油 (Milk and cream)：試樣離心得到約含 40%脂肪之乳油，旋轉攪拌乳油後收集乳酪部分，以下步驟按第 2.1.3.1.1 節操作。 2.1.3.1.3 乾酪 (Cheese)：

5、用無水硫酸鈉以磨碎 機磨碎試樣，直到生成粒狀止，移入連續式萃取裝置中以正戊烷或石油醚收集之，回收萃取液於粗脂肪瓶，並置於沸水浴上去除殘存溶劑。 2.1.3.1.4 煉乳、蒸發乳及冰淇淋 (Condensed milk, evaporated milk and ice-cream)：加 2 倍試樣體積的沸水且在沸水水浴上加熱使混合液之溫度升至 75後，加混合液之 1/10 量的硫酸銅溶液，繼續加熱至沉澱物產生為止，過濾後，沉澱物以溫水洗至濾液為無色止，小心地使沉澱物之水滴乾，加無水硫酸鈉將之磨碎成粒狀，以下步驟按第 2.1.3.1.3 節操作。 2.1.3.1.5 乳粉 (Dried milk)

6、：加少量水磨碎使成凝結狀，靜置約 15 分鐘後，加無水硫酸鈉，再磨碎直到生成粒狀，以下步驟按第2.1.3.1.3 節操作。 2.1.3.2 洋地黃皂苷固醇 (Sterol digitonides)的製備：精確稱取試樣 15 g 於三角燒瓶中，加氫氧化鉀溶液 10 mL 及 95 %乙醇 (v/v)20 mL 後裝上空氣冷凝管上，放置於沸水浴上加熱，直到溶 液變為澄清，再繼續加熱沸騰30 分鐘，注入水 60 mL，再加 95%(v/v)乙醇 180 mL，加熱使溫度達40左右，加洋地黃皂苷酒精溶液 30 mL，冷卻後，放入 5冰箱中經12 小時，以中速之濾紙過濾，收集洋地黃皂苷固醇沉澱物，再以

7、5冷水洗沉澱物直到濾液不生泡沫後，再以 95%(v/v)乙醇 25 50 m L 及乙醚 25 50 mL 洗之，將濾紙及沉澱物置於錶玻皿上，以 (102 2)烘箱中乾燥 10 15 分鐘，將濾紙折成 2 折，將薄片狀之沉澱物移入稱量瓶中。 備考：固醇含量，可由沉澱物秤重後，再依下列公式計算 0101mm25100mm25.0= 式內， m0：試樣重 (g)， m1：固醇沉澱物重 (g) 2.1.3.3 固醇的調製：在小試管中溶解洋地黃皂苷固醇 10 mg 於甲醯胺與二甲基甲醯胺混合液 0.5 mL 中，如有需要稍微加熱，放冷後加正戊烷 2.5 mL，加蓋搖勻後，使之分層且取含有游離固醇之上層

8、透明之正戊烷層，供作氣相層析分析之用，此溶液含有約 1 mg / mL 的固醇。 2.1.3.4 靈敏度試驗液 (Sensitivity test solution)調製：現調製之乳脂肪固醇於 1 mg 溶於的正戊烷 1 mL 中 (參照第 2.1.3.2 節與第 2.1.3.3 節 ) 2.1.3.5 波峰解析試驗液 (Peak resolution test solution)調製：將現調製之菜籽油固醇 0.9 mg 及乳脂固醇 0.1 mg 溶於正戊烷 1 mL 中 (參照第 2.1.3.2 節3 CNS 11737, N 6203 與第 2.1.3.3 節 ) 2.1.3.6 參考試驗

9、液 (Reference test solution)調製：現調製之黃豆油固醇 1 mg於正戊烷 1 mL 中 (參照第 2.1.3.2 節與第 2.1.3.3 節 ) 2.1.3.7 判定 2.1.3.7.1 靈敏度試驗：注入 3 5 L 之靈敏度試驗液，在氣相層析圖譜上僅出現一個 Cholesterol 之波峰。 2.1.3.7.2 波峰解析試驗 )：注入 3 5 L 之波峰解析試驗液，在氣相層析圖譜上有 Cholesterol, Brassicasterol, Campesterol 及-Sitoesterol 之波峰，量測各滯留距離及波峰寬 度且其波峰解析值至少為 1。 2.1.3.7

10、.3 參考試驗：注入 3 5 L 參考試驗 液在氣相層析圖譜上有Campesterol, Stigmesterol 及 -Sitoesterol 之波峰，量測各滯留距離並計算出其相關之滯留時間，其數據大致如下： 膽固醇 1.00(滯留時間約 15 分鐘 ) Brassicasterol 1.13 至 1.15 Campesterol 1.32 至 1.34 Stigmesterol 1.44 至 1.46 -Sitoesterol 1.66 至 1.68 2.1.3.7.4 定性：將檢液 3 5 L 注入氣相層析儀，並記錄其氣相層析圖譜。當圖譜在 -Sitoesterol 相關之滯留時間有波峰

11、出現，且其高度為全圖高的 2 %以上時，判定含有植物脂肪。若 GC 圖譜上出現其他植物固醇，如 Campesterol, Stigmesterol，可支持含有植物脂肪之判定。 2.1.3.7.5 靈敏度：本方法 -Sitoesterol 之偵測極限為 0.5 %，但是乳脂肪中的植物脂肪含量則會受添加脂肪中 -Sitoesterol 含量影響，而無法得到其偵測極限。 2.2 固醇醋酸鹽法 2.2.1 裝置、器具及材料 2.2.1.1 分析天平：精確至 0.0001 g。 2.2.1.2 三角燒瓶：容量為 500 mL，瓶口可裝上空氣冷凝管。 2.2.1.3 玻璃微濾器裝置 (Micro-filt

12、ering device)。 2.2.1.4 熔點測定裝置 (Melting point apparatus)。 2.2.1.5 熔點測定管 (Melting point tubes)。 2.2.1.6 一般或偏光顯微鏡 (Ordinary or polarizing microscope)：放大倍數 200 倍。 2.2.1.7 乾燥烘箱：可控制溫度於 (1022)。 2.2.1.8 甘油浴：可控制溫度於 130 145。 2.2.2 試藥 2.2.2.1 正戊烷或石油醚。 4 CNS 11737, N 6203 2.2.2.2 氫氧化鉀溶液：溶解氫氧化鉀 400 g 於水 600 mL 中

13、。 2.2.2.3 洋地黃皂苷酒精溶液：取洋地黃皂苷10 g 溶於 95% (v/v)乙醇 1 L 中。 2.2.2.4 乙醇： 95% (v/v)。 2.2.2.5 乙醇： 80% (v/v)。 2.2.2.6 乙醚。 2.2.2.7 醋酸酐。 2.2.2.8 正戊烷或石油醚。 2.2.2.9 硫酸銅溶液：取硫酸銅 70 g 溶於蒸餾水 1 L 中。 2.2.2.10 無水硫酸鈉。 2.2.3 步驟 2.2.3.1 試樣的調製及洋地黃皂苷固醇的製備依第 2.1.3.2 節及第 2.1.3.3 節步驟。 2.2.3.2 製備固醇醋酸鹽 (steryl acetate)及測定熔點 2.2.3.2

14、.1 將洋地黃皂苷固醇 (0.10.005)g 移入試管中，加入醋酸酐 1 mL並以甘油浴加熱試管 130 145直到沉澱物溶解。不可以直接加熱，因為可能會濺出來。持續加熱 2 分鐘，再冷卻至約 80。 2.2.3.2.2 加入乙醇 4 mL，稍微混合並加熱以溶解可能結晶出的固醇醋酸鹽。 2.2.3.2.3 經由已浸有乙醇的小型中速濾紙趁熱過濾，將濾液收集至另一根試管。 2.2.3.2.4 將試管中的濾液小心的加熱直至溫和沸騰。 2.2.3.2.5 劇烈搖晃試管，讓溶液保持沸騰，慢慢由吸管一滴一滴加入 1 1.5 mL 水，直到固醇醋酸鹽幾乎要由溶液中沉澱出。 2.2.3.2.6 再加入數滴乙

15、醇溶解任何沉澱出的固醇醋酸鹽。 2.2.3.2.7 放在室溫 2 小時後，在放入冰水中 30 分鐘。 2.2.3.2.8 使用硬質快速濾纸以微濾器抽氣過濾固醇醋酸鹽結晶，並以乙醇 1 mL 沖洗結晶。 2.2.3.2.9 將結晶塊放入試管中加乙醇 1 mL，以微火加熱溶解。 2.2.3.2.10 起先 15 分鐘先於室溫冷卻，再放入冰水 5 分鐘。如第 2.2.3.2.8節過濾固醇醋酸鹽結晶。 2.2.3.2.11 重複步驟第 2.2.3.2.9 節至第 2.2.3.2.10 節。假如需要重複這些步驟至少 2 次。 2.2.3.2.12 先以約 30烘乾濾纸上的結晶塊，再放入乾燥烘箱中，以溫度

16、(1022)烘 10 15 分鐘。 2.2.3.2.13 將結晶塊在表玻璃上弄破、混合，並填充至熔點測定管中約 3 mm 高。以熔點裝置測定熔點，在熔解後期以 0.5 /min之速率升高溫度。當最後的結晶都已熔解時，記錄此時溫度計上之熔點溫度至 0.1。 2.2.3.3 顯微鏡鏡檢：僅在固醇醋酸鹽之熔點大於等於 115.5，但小於 117時需實施。 5 CNS 11737, N 6203 2.2.3.3.1 在小試管中以乙醇 1 mL 溶解固醇醋酸鹽約 0.01 g 並加入氫氧化鉀溶液 1 2 滴。 2.2.3.3.2 在沸水浴上加熱直至沸騰及固醇醋酸鹽溶解。 2.2.3.3.3 加入水 10

17、 mL，並移入分液漏斗中，以乙醚 25 mL 萃取。 2.2.3.3.4 當分層時，排掉及丟棄水層。 2.2.3.3.5 以水 5 mL 洗三次乙醚層。 2.2.3.3.6 將乙醚層移入 50 mL 燒杯中，並蒸發至乾。 2.2.3.3.7 將殘渣以 80%乙醇 10 mL 溶解。放一滴澄清液至顯微鏡蓋玻片(Cover slip)，讓溶液佈滿片上。直至蓋玻片的邊緣開始有結晶產生，翻轉蓋玻片放置於載玻片上。 2.2.3.3.8 當有更多結晶產生後，以 200 倍的顯微鏡觀察。 2.2.3.4 結果判定 2.2.3.4.1 如果固醇醋酸鹽熔點是介於 114.0 115.5之間，則實驗室試樣將被認為

18、不含植物脂肪。 2.2.3.4.2 如果固醇醋酸鹽熔點是大於等於 117.0，則此試樣將被認為含有植物脂肪。 2.2.3.4.3 固醇醋酸鹽之熔點大於等於 115.5，但小於 117時，重複溶解、再結晶及過濾等步驟至少兩次 (見第 2.2.3.2.11 節 )，乾燥結晶塊和重覆第 2.2.3.2.12 節及第 2.2.3.2.13 節步驟測定熔點。 (1) 如果此時固醇醋酸鹽熔點是大於等於 117.0，則此試樣將被認為含有植物脂肪。 (2) 如果此時固醇醋酸鹽之熔點依然大於等於 115.5，但小於117。則試樣需依步驟第 2.2.3.3 節進行顯微鏡檢。 (3) 如果顯微鏡鏡檢顯示，固醇晶體僅

19、有鈍角為 100之平行四邊形的形式存在 (如圖 1)，則實驗室試樣將被認為不含植物脂肪。 (4) 如果顯微鏡鏡檢顯示，有一些固醇晶體為拉長的六邊形，其頂點角度為 108，此為植物固醇的 特徵，或者有一些固醇晶體含有凹角 (燕尾 )，此為含有植物固醇與膽固醇混合物的特徵 (如圖 1)，則此試樣將被認為含有植物脂肪。 6 CNS 11737, N 6203 圖 1 植物固醇與膽固醇混合物的特徵 2.2.3.5 靈敏度與加入植物脂肪的性質有關，例 如植物脂肪中的植物固醇混合物的量及種類。 2.2.3.6 測試報告：測試報告將含有熔點、再結晶的次數 ，假如有顯微鏡鏡檢應將使用方法及觀察固醇結晶的狀況描 述於報告，本方法的操作細節及任何會影響測試結果的事件皆須提及 。測試結果應包含完整證明辨別試樣所需的資訊。 相對應國際標準： ISO 3594-1976(E), Milk fat Detection of vegetable fat by gas-liquid chromatography of sterols( Reference method) ISO 3595-1976(E), Milk fat Detection of vegetable fat by the phytosteryl acetate test