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CNS 9028-2007 Method of test for feed additives - General rules for microbiological determination of antibiotics《饲料添加物检验法-抗生素之微生物测定法通则》.pdf

1、1 印月964月 本標準非經本局同意得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 號 ICS 65.120.00 N40989028經濟部標準檢驗局印 公布日期 修訂公布日期 716月17日 964月10日 (共7頁)飼料添加物檢驗法抗生素之微生物測定法通則 Method of test for feed additives General rules for microbiological determination of antibiotics 1. 適用範圍:本標準規定配合飼料中抗生素之微生物測定法之一般通則。 2. 培養基(可用去離子水準備培養基) 2.1 瓊脂培養基A(Agar mediu

2、m A)(抗生素培養基1,Antibiotic medium 1)蛋白腖(Peptone) 6.0 g胰消化酪蛋白(Pancreatic digest of casein) 4.0 g 酵母萃取物(Yeast extract) 3.0 g 牛肉萃取物(Beef extract) 1.5 g 無水葡萄糖(Dextrose) 1.0 g瓊脂(Agar) 15.0 g蒸餾水 加至1000 mL 以1 N NaOH或1 N HC1調整pH值為(6.50.1),加熱溶解後,以121 滅菌15 min。作為枯草菌素、泰黴素、紅黴素、林可黴素、青黴素、鏈黴素、安痢黴素、純黴素及四環黴素類測定使用。 2.2

3、瓊脂培養基B(抗生素培養基4) 蛋白腖(Peptone) 6.0 g 酵母萃取物(Yeast extract) 3.0 g 牛肉萃取物(Beef extract) 1.5 g 無水葡萄糖(Dextrose) 1.0 g瓊脂(Agar) 15.0 g蒸餾水 加至1000 mL 以1 N NaOH或1 N HC1調整pH值為(6.50.1),加熱溶解後,以121 滅菌15 min。作為青黴素及安巴素測定使用。 2.3 瓊脂培養基C(抗生素培養基2) 蛋白腖(Peptone) 6.0 g 酵母萃取物(Yeast extract) 3.0 g 牛肉萃取物(Beef extract) 1.5 g 瓊脂(

4、Agar) 15.0 g蒸餾水 加至1000 mL 以1 N NaOH或1 N HC1調整pH值為(6.50.1),加熱溶解後,以121 滅菌15 min。作為枯草菌素測定使用。 2 CNS 9028, N 4098 2.4 瓊脂培養基D(抗生素培養基8):將瓊脂培養基C以1 N NaOH或1 N HC1調整pH值為(5.80.1)。作為四環黴素類測定使用。 2.5 瓊脂培養基E(抗生素培養基5):將瓊脂培養基C以1 N NaOH調整,使最終pH值為(7.90.1)。作為鏈黴素及效高黴素測定使用。 2.6 瓊脂培養基F將瓊脂培養基A每公升以3.5 N NaOH 2.83.8 mL調整,使滅菌後

5、之pH值為(9.00.1)。作為觀黴素測定使用。 2.7 瓊脂培養基G(抗生素培養基32):於瓊脂培養基A每公升加入300 mg MnSO4H2O或0.4 mL 1% MnCl2液。作為孟寧素測定使用。 2.8 瓊脂培養基I 蛋白腖(Peptone) 9.4 g酵母萃取物(Yeast extract) 4.7 g 牛肉萃取物(Beef extract) 2.4 g 氯化鈉(NaCl) 10.0 g無水葡萄糖(Dextrose) 10.0 g無水磷酸二氫鉀(KH2PO4) 13.0 g 磷酸氫二鈉(Na2HPO47H2O) 1.0 g瓊脂(Agar) 23.5 g蒸餾水 加至1000 mL 以1

6、 N HC1調整pH值為(5.40.1),加熱溶解後,以121 滅菌15 min。作為寧畜定測定使用。 2.9 瓊脂培養基J(抗生素培養基11):將瓊脂培養基A以1 N NaOH調整,使最終pH值為7.98.0。作為泰黴素、紅黴素、林可黴素及歐黴素測定使用。 2.10 培養計數培養基(Plate count agar)(Tryptone glucose yeast agar) 蛋白腖(Peptone) 5.0 g 酵母萃取物(Yeast extract) 2.5 g 無水葡萄糖(Dextrose) 1.0 g瓊脂(Agar) 15.0 g蒸餾水 加至1000 mL 加熱溶解後,以121 滅菌1

7、5 min。檢驗當天以1 N HC1調整pH值為6.0,作為安痢黴素測定使用。 2.11 瓊脂培養基L 無水磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0.69 g 無水磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.45 g酵母萃取物(Yeast extract) 2.5 g 無水葡萄糖(Dextrose) 10.0 g瓊脂(Agar) 15.0 g蒸餾水 加至1000 mL 加熱溶解後,以121 滅菌15 min。檢驗當天以1 N HC1調整pH值為6.0,3 CNS 9028, N 4098 作為孟寧素測定使用。 2.12肉湯培養液A(Broth medium A)(抗生素培養基3) 蛋白腖(Peptone) 5.0

8、g 酵母萃取物(Yeast extract) 1.5 g 牛肉萃取物(Beef extract) 1.5 g 氯化鈉(NaCl) 3.5 g無水葡萄糖(Dextrose) 1.0 g無水磷酸氫二鉀(K2HPO4) 3.68 g 無水磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.32 g蒸餾水 加至1000 mL 以1 N NaOH或1 N HC1調整pH值為6.957.05,加熱溶解後,以121 滅菌15 min。作為枯草菌素及恩黴素測定使用。 2.13 肉湯培養液B(Broth medium B) 胰消化酪蛋白(Pancreatic digest of casein) 5.0 g 胰消化動物組織(Panc

9、reatic digest of animal tissue) 5.0 g 無水葡萄糖(Dextrose) 20.0 g蒸餾水 加至1000 mL 以1 N NaOH或1 N HC1調整pH值為5.65.7,加熱溶解後,以121 滅菌15 min。作為寧畜定測定使用。 3. 試劑 3.1 磷酸鹽重碳酸鹽緩衝液,pH 8:將16.73 g無水K2HPO4,0.523 g無水KH2PO4,及20 g NaHCO3溶解於水中,然後稀釋成1 L。作為歐黴素測定使用。 3.2 磷酸鹽緩衝液pH 8,0.1M:將16.73 g無水K2HPO4及0.523 g無水KH2PO4,溶解於水中,然後稀釋成1 L。

10、作為新黴素、鏈黴素、安痢黴素及康黴素測定使用。 3.3 磷酸鹽緩衝液pH 7,0.1 M:將13.6 g無水K2HPO4及4 g無水KH2PO4溶解於水中,然後稀釋成1 L。作為效高黴素測定使用。 3.4 5 %磷酸鹽緩衝液pH 6.5:將22.15 g無水K2HPO4及27.85 g無水KH2PO4溶解於水中,並稀釋成1 L。作為枯草菌素測定使用。 3.5 10 %磷酸鹽緩衝液pH 6:將80 g無水KH2PO4及20 g無水K2HPO4溶解於水中,然後稀釋成1 L。作為寧畜定測定使用。 3.6 1 %磷酸鹽緩衝液pH 6:將8.0 g無水KH2PO4及2 g無水K2HPO4溶解於水中,然後

11、稀釋成1 L。作為枯草菌素及青黴素測定使用。 3.7 磷酸鹽緩衝液pH 4.5,0.1 M:將13.6 g無水KH2PO4溶解於水中,然後稀釋成1 L。作為安巴素測定使用。 3.8 吡啶緩衝溶液(Pyridine-buffer solution):將4容積吡啶與3容積5 %磷酸鹽緩衝液混合均勻。作為枯草菌素測定使用。 3.9 40 %吡啶緩衝溶液:將4容積吡啶與3容積5 %磷酸鹽緩衝液及3容積水混合均勻。作為枯草菌素測定使用。 4 CNS 9028, N 4098 3.10 酸性丙酮:將丙酮(acetone)650 mL、濃鹽酸25 mL,加蒸餾水至1000 mL。作為安巴素測定使用。 3.1

12、1 酸性甲醇:將1 N HC1 20 mL,加甲醇至1000 mL。作為觀黴素測定使用。 3.12 氫氧化鈉(NaOH)/乙二胺四醋酸(EDTA)萃取溶液:將NaOH 60 g、EDTA 7.45 g,加去離子水至1000 mL。作為安痢黴素測定使用。 3.13 丙酮/鹽酸萃取溶液:將丙酮與0.5 N HCl,以3:7容積比例混合。作為恩黴素測定使用。 3.14 Tris緩衝液pH 8.0,0.05 M:將6.05 g Tris(hydroxy-methyl)aminomethane溶解於900 mL水中,以HC1調整pH為8.0,然後稀釋成1 L。作為觀黴素測定使用。 3.15 磷酸鹽緩衝液

13、pH 6.8:將5.95 g無水Na2HPO4及4.53 g無水KH2PO4溶解於蒸餾水調整至1 L。作為純黴素測定使用。 3.16 磷酸鹽緩衝液pH 8.0,0.2 M:將34.84 g無水K2HPO4溶解於1000 mL水中,再以27.22 g無水KH2PO4溶解於1000 mL水中,以後者將前者調成pH 8.0(每1 L約需100 mL KH2PO4溶液)。作為安痢黴素測定使用。 3.17 滅菌之等張生理鹽水:將9.0 g NaCl溶解於水中,然後稀釋成1 L。在121 蒸氣滅菌20 min。作為純黴素及富樂黴素測定使用。 3.18 醋酸鉛溶液:將303 mg Pb(CH3COO)23H

14、2O溶於水中,然後以水稀釋成1 L。作為觀黴素測定使用。 4. 裝置 4.1 不銹鋼圓筒(Stainless steel cylinder):外徑(80.1)mm,內徑(60.1)mm,高(100.1)mm。 4.2 培養皿(平板):玻璃或塑膠製品,100 mm寬,20 mm深。表面有上釉之瓷製蓋子,或蓋子內有濾紙墊以便吸收膠體脫水收縮作用所產生之水分。如果玻璃或塑膠製蓋子能使水分逸出者亦可使用。 4.3 圓筒配置器(Cylinder dispenser)。 4.4 加熱墊(Heating mat):Masonito(一種保溫硬質纖維板),20245/16或類似之物品。枯草菌素測定使用。 4.

15、5 鋁製空氣散播器(Aluminum air sparger):由2.8 m長之0.25鋁管製成,在短端64、132及200 cm(25、52及79)處做3個半圓形之彎曲,並在長端之開始17 cm(6.5)處作70度之彎曲。將散播器置於二段木頭上442.51.3 cm(17.510.5)。在支撐之木頭間每隔10 cm(3.75)以0.2 cm(1/16)之鑽孔器鑽洞,共鑽16個洞,在支撐木頭外頭分別鑽8個洞,並且使所鑽之洞正好位於所有要供氣之培養皿中央之上方。將散播器之兩端以Tygon管與玻璃製之Y型管相連接。與供應276345 KPa(4050 lb/in2)之供氣管連接並且裝置防水通過之凝

16、氣瓣。枯草菌素測定使用。 4.6 測徑用游標尺 4.7 洛氏瓶 5 CNS 9028, N 4098 5. 試驗用菌液之裝備 下列之細菌在一支或以上之由瓊脂培養基A製成之斜面培養基(Slant culture)上,於所指定之溫度培養一夜,其溫度保持於0.5之恆定範圍內。然後儲存於210 之暗處,在2週內使用。 5.1 Micrococcus flavus ATCC 10240 (BCRC 10452):將菌種培養基(Stock culture)在3235培養。以約3 mL之肉湯培養液A洗得菌液,然後將菌液移至含有300 mL瓊脂培養基A之洛氏瓶(Roux bottle)或類似洛瓶之表面,並以滅

17、菌之玻璃珠將菌液均勻的散布在培養基表面。在3235 下培養一夜,再以約25 mL之滅菌等張生理鹽水將生長於培養基表面之菌體洗下。將此菌液儲存於210 ,在枯草菌素及恩黴素測定時使用。 5.2 Sarcina subflava ATCC 7468 (BCRC 11544):將菌種培養基培養在3235 。如第5.1節方法準備菌液,作為測定枯草菌素用之替代菌株。 5.3 Bacillus cereus ATCC 11778 (BCRC 10446):將菌種培養基在30 培養,然後以約3 mL之滅菌水洗得菌液,再將菌液轉移至300 mL,瓊脂培養基A之表面,在30 培養7天。以20 mL滅菌水洗得菌液

18、,在65 加熱30 min,然後離心並除去上清液。將餘留之芽胞以滅菌水洗滌3次,每次並離心及除去上清液。將剩下之芽胞於65 加熱30 min,然後懸浮於滅菌之生理鹽水中。將此菌液原液儲存於210 。作為氯四環素及羥四環素之測定用。 5.4 Bacillus subtilis ATCC 6633 (BCRC 10447):將菌種培養基培養在37 ,然後以約3 mL之滅菌等張生理鹽水洗得菌液,轉移菌液至裝有300 mL瓊脂培養基G之洛氏瓶內之培養基表面,在37 培養7天。以約50 mL之滅菌等張生理鹽水洗滌培養基表面,將洗得之菌液置於離心管內,在65 水浴槽內放置30 min,以殺死繁殖型細菌,經

19、過離心後,除去上清液,將菌體再懸浮於約50 mL之滅菌等張生理鹽水內。重覆加熱,離心,再懸浮之步驟2次或直到上清液變清徹為止。最後之懸浮液即為菌液原液,儲存於210 。作為效高黴素、孟寧素、鏈黴素、安痢黴素、北里黴素及康黴素測定之用。ATCC 11774 (BCRC 16068)則作為安巴素測定之用。 5.5 Sarcina lutea Kocuria rhizoohila ATCC 9341a (BCRC 11541):將菌種培養基培養在2030 ,以約3 mL之肉湯培養液A洗滌培養24 hr之培養基斜面,然後將此菌液轉移至裝有300 mL瓊脂培養基A之洛氏瓶培養基表面,由滅菌玻璃珠將此菌液

20、均勻的散布在培養基表面,在2632 培養24 hr。以約15 mL之滅菌等張生理鹽水洗得菌液,將此菌液原液儲存於210 ,並於2週內使用。作為紅黴素、林可黴素、諾伯黴素、歐黴素、青黴素及泰黴素等測定之用。 5.6 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (BCRC 11030):將菌種培養基培養在32 ,由菌種培養基釣取白金環之菌體接種於含有30 mL肉湯培養基A之300 mL燒瓶內,在2632 培養一夜。需當日製備使用。作為新黴素測定之用。 5.7 Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 (BCRC 20822):使用瓊脂培養

21、菌基1,將菌種培養在37 ,由菌種培養基釣取白金環之菌體接種於100 mL之肉湯6 CNS 9028, N 4098 培養B,在37 培養一夜,此即為試驗用菌液,在210 保存,並於2週內使用。作為寧畜定測定之用。 5.8 Escherichia coli ATCC 10536 (BCRC 10450),將菌種培養基培養在36 ,由菌種培養基接種於盛有30 mL肉湯培養基A之250 mL之燒瓶內,在36 培養1824 hr。製備後當日使用。作為觀黴素測定之用。 5.9 Corynebacterium xerosis ATCC 373 (BCRC 13877; NCTC 9755):使用瓊脂培養

22、基A(本標準第2.1節)保存原始菌種,每週轉至新鮮培養基,於37 培養24 hr後,以10 mL滅菌生理鹽水收集單一培養基斜面之菌體。於測定抗生素前將1 mL菌體懸浮液接種於100 mL肉湯培養液A (本標準第2.14節),在37 震盪培養16 hr。作為純黴素及硫肽黴素測定之用。 5.10 Staphylococcus aureus ATCC 6538P (BCRC 10451):將菌種培養基在37 培養一天後,置於冰箱中保存,每二個月繼代一次。作為富樂黴素測定之用。 5.11 Bacillus mycoides ATCC 11778 (BCRC 10466):使用瓊脂培養菌基1,將菌種在3

23、0 培養(171)小時。作為四環黴素類測定之用。 6. 標準曲線之製作 6.1 準備修正濃度(標準)液及各種(標準)濃度液,見各抗生素檢驗法,同時準備欲測之樣品溶液。 6.2 準備裝有適當之底層及(或)種層平皿培養基,見各抗生素檢驗法,備製時,以繞圓之動作搖動培養皿,使溶解之瓊脂能夠均勻的分布在培養皿內,然後使之自然凝固。培養皿需在製成同批次使用。 6.3 於平皿培養基上按約60度圓心角放置6個不銹鋼圓筒,各圓筒與圓心距離為2.8 cm,將不相鄰之3個圓筒注入修正濃度液,剩下3個圓筒注入其餘之一種標準稀釋液,除修正濃度以外之每一濃度3枚平皿培養基。 6.4 在適當溫度下培養一夜,然後儘可能精細

24、的測定抑制圈直徑至0.1 mm。 6.5 在同一濃度之3枚平皿培養基組,可得到9個修正濃度之抑制圈及9個該一種標準稀釋液之抑制圈。 6.6 計算4組共12枚平皿培養基上之36個修正濃度抑制圈之平均值,並作為校正點(Correction point),以此值與各組9個修正濃度抑制圈平均值之差,調整各標準稀釋抑制圈直徑平均值。 例如:當校正點20.0 mm,而某組9個修正濃度之平均值為19.8 mm時,需校正+0.2 mm;即當同組之9標準稀釋液抑制圈直徑之平均值為17.0 mm時,校正值為17.2 mm。 6.7 取校正點及各濃度標準稀釋液校正值為橫軸,濃度為縱軸,在雙週期之半對數方格紙上標示,

25、或依下式計算則得代表各濃度之最適標準曲線。 L=(3a+2b+ce)/ 5 H=(3c+2d+ca)/ 5 其中L、H各為計算後之最低和最高濃度時抑制圈之直徑,a, b, c, d, e為各最低至最高標準稀釋液之校正值。 7 CNS 9028, N 4098 如以特殊之3種標準稀釋液計算時,其公式如下 L=(5a+2b+c)/ 6 H=(5c+2ba)/ 6 如為4種標準稀釋液計算時之公式如下 L=(7a+4b+c2d)/ 10 H=(7d+4c+b2a)/ 10 上述公式只有在各標準稀釋液以對數尺度(log scale)表示時顯呈等距離,才能適用。 6.8 將L值與H值畫出,並以直線連接,參

26、考點為修正濃度在曲線上之抑制圈直徑。標準曲線斜率B=(HL)/(logH-logL),其中H及L為最高及最低標準濃度,而B則為抗生素濃度增加每10倍時,抑制圈所增大之大小。 7. 供檢溶液濃度之測定 7.1 每個供檢溶液需作3枚培養皿。 7.2 每個培養皿內不相鄰之3個圓筒內注入修正濃度液,剩下3個圓筒注入供檢溶液,在適當的溫度過夜培養,然後測量抑制圈大小。 7.3 分別求9個修正濃度及9個供檢溶液之抑制圈直徑之平均值,如果測定溶液所測得之平均值大於修正濃度之平均值,則在標準曲線上之參考點加上此值。如果測定溶液所測得之平均值小於修正濃度之平均值,則在標準曲線上之參考點減去此值。 7.4 以測定溶液之校正值,由標準曲線計算抗生素之含量。 7.5 計算相對濃度對數M=(uysy )/ B,其中uy,sy分別為測定溶液及修正溶液之9個測定平均值,B則為標準曲線之斜率。Antilog(M)=測定溶液濃度與標準濃度之比。而Antilog(M)100=測定溶液之濃度佔標準修正濃度之百分比。

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